摘  要：前期实验课题组构建了以羰基还原酶作为还原剂催化酶，以甲酸脱氢酶做为辅助酶，协同催化（R）-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中3位羰基转化为羟基的反应体系，从而得到阿伐他汀重要手性中间体6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯。本课题拟针对该工程菌进行诱导产甲酸脱氢酶条件的优化，重点考察对诱导过程产生影响的4个因素，诱导时间、诱导温度、诱导剂的添加量及诱导前生长时间的不同，对菌体产还原酶能力的影响，直观分析得出诱导温度的25℃,诱导时间2 h，诱导剂IPTG 浓度0。50 mmol/L，诱导前生长时间2 h后的酶活最高，此方案最佳；诱导过程中转速始终保持200 r·min-1。通过进行诱导产酶条件的优化的探讨，以期获得高表达量的甲酸脱氢酶促进后续羰基还原反应的转化效率。91503

毕业论文 关键词：条件优化，6-氰基-（3R,5R）-二羟基已酸叔丁酯，甲酸脱氢酶，辅酶再生

Abstract: (R) -6-cyano-5-hydroxy-3-carbonylhexanoic acid tert-butyl ester was synthesized by using carbonyl reductase as reductant catalytic enzyme and formic acid dehydrogenase as auxiliary enzyme。 3-carbonyl group to a hydroxyl group to give a carbonyl reductase of tert-butyl 6-cyano- (3R, 5R) -dihydroxyhexanoic acid。 In this study, four factors, induction time, induction temperature, addition amount of inducer and different growth time before induction were studied。 The factors influencing the inducing process were studied。 The results showed that the optimal conditions of the experiment were verified by the experimental results。 Results: The induction temperature was 25℃, the induction time was 2 h, the concentration of IPTG was 0。50 mmol / L, and the activity was the highest after 2 h before induction。 The optimal rate was 200 R·min-1。 In order to obtain high expression amount of formate dehydrogenase to promote the conversion efficiency of subsequent carbonyl reduction reaction。

Keywords: conditional optimization; 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxyhexanoate t-butyl ester; formate dehydrogenase; coenzyme regeneration

目 录

第一章 文献综述5

1。1前言·5

1。2辅酶再生的方法5

1。2。1各种辅酶再生方法的比较6

1。2。2研究目的及意义 ·6

第二章 实验材料与方法7

2。1实验材料·7

2。1。1实验仪器7

2。1。2实验试剂·7

2。1。3缓冲溶液、培养基·8 

2。2实验方法8

2。2。1重组菌的诱导表达·9

2。2。2甲酸脱氢酶酶活的测定·9

第三章 诱导条件的优化·10

3。1诱导温度对酶活性的影响 10

3。2诱导时间对酶活的影响·10

3。3诱导前生长时间对酶活的影响 11

3。4诱导剂的用量对酶活的影响·11

第四章 结论与展望13

参考文献·14

致谢15

第一章 文献综述

1。1前言来自优I尔Y论S文C网WWw.YoueRw.com 加QQ7520~18766

自20世纪80年代以来，现代制药企业着眼于生物催化方法，在手型合成中由于反应条件温和，光学选择性高，环境友好等特点尤为重视，如何筛选开发酶活力好，选择性好，能在底物含量较高，辅酶添加量较低的反应体系成为重要研究课题。而氧化还原酶工业应用的关键在于，辅酶再生去实现氧化还原酶催化反应。在辅酶再生的方法中，通过比较电化学法、光化学法及酶法的优缺点及应用，得出酶法再生以反应速率快、光学选择性高、反应过程易于监督等优势，受到更广泛的青睐。目前工业应用中研究最广泛的辅酶是甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。在酶的六大类型中，三分之一为氧化还原酶，氧化还原酶的重要的用途在制药、食品、精细化工、农药等领域，主要是用来制备手性化合物，例如羟基酸类、氨基酸、类固醇、手性醇类等等[1]。辅酶在氧化还原酶反应过程中提供氢或电子的传递体，大多数的氧化还原酶需要NAD，NADH作为辅酶，只有少数的酶以NADP，NADPH为辅酶[2]。氧化还原酶在参与生物催化合成时，在得到产物的同时要使用一定量的辅酶，因此，提高辅酶的高效开发供应便成为氧化还原酶参与生物催化反应的关键问题。由于辅酶稳定性低，价格昂贵，不能用一般的合成物质替代等特点，所以在生产过程中大剂量添加辅酶是不切实际的，从而限制了氧化还原酶的应用。因此，从工业应用的经济性角度来看，对辅酶进行再生并循环使用是很重要的课题研究。辅酶再生就是让辅酶保持在一定的催化剂量状态，在反应过程中始终存在催化作用，从氧化态再生为还原态，或者从还原态再生为氧化态。论文网