2  材料与方法

2。1  实验材料

2。1。1  菌株来自优I尔Q论T文D网WWw.YoueRw.com 加QQ7520~18766

自然界中的酶种类繁多，为了获得具有高立体选择性和催化活性的羰基还原酶，传统的做法是从富含微生物的土壤或其它环境样品中进行筛选并分离获得。菌体初步筛选我们分别采用了淮安、无锡、南京、南通、苏州等地的土壤，通过富集培养基和筛选平板培养基分离出若干对底物具有耐受性的菌株，再进行发酵培养，收集菌体进行生物转化反应，筛出转化效果明显的菌体，本实验中所用菌种来自江苏淮安桃花坞公园。

2。1。2  培养基

富集培养基配制(g/L)：Yeast(酵母粉)20。0、葡萄糖50。0、磷酸二氢钾4。0。

筛选平板培养基配制(g/L)：氯化钠0。1、七水合、磷酸二氢钾 0。2、硫酸铵 0。2

硫酸镁0。02、琼脂20。0。待平板冷却凝固后，取1 mL 浓度为1 g/L 无水乙醇溶解的底物溶液，将其涂布于直径 9 cm 平板表面。

丰富平板培养基配制(g/L)：葡萄糖25。0、酵母浸粉10。0、磷酸二氢钾4。0、七水合硫酸镁1。5、琼脂条20、调 pH 6。0。

固体培养基配制(g/L)：Yeast(酵母粉)10。0、蛋白胨20。0、葡萄糖20。0、琼脂20。0。

发酵培养基配制(g/L): Yeast(酵母粉)20。0、葡萄糖50。0、磷酸二氢钾4。0、七水合硫酸镁1。5、pH 6。0。

2。1。3  试剂

CPMK[(S)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲酮]性质：不溶于水，易溶于有机溶剂；其他试剂均为市售。

2。2  实验方法

2。2。1  菌体筛选 

开始做准备工作：洗好锥形瓶、平板，称取5 g 土壤样品于锥形瓶中，加入50 mL 灭菌生理盐水，放5颗灭菌玻璃珠，然后摇晃20 min，静置，取上清液接种到50 mL富集培养基中，放入摇床在200 r/min、30 ℃的条件下培养12 h 后，取稀释10-1和10-2等梯度稀释涂布于筛选平板培养基。2 d后平板表面长出一块一块的菌落，然后将菌转接到丰富平板培养基上培养，24 h后会生长成菌落。取20 mL发酵培养基于灭过菌的50 mL离心管中，接种丰富平板培养基上的菌落并放入摇床在30 ℃、200 r/min的条件下培养48 h。之后用高速冷却离心仪4 min 倒去上清液，收集菌体，将细胞用生理盐水洗涤两次后进行生物转化反应。具体步骤为：配制体系5%葡萄糖和3。5 g/LCPMK的0。2 MPBS(pH6。5)溶液，加入菌体，放入摇床，温度控制在35 ℃，转数200 r/min ，反应48 h。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液的上清液，用正己烷/异丙醇（9/1, v/v）制备分散剂，然后用薄层色谱法（TLC）进行检测。将具有转化CPMK能力的菌株检测挑选出。把筛选出的优质菌体放入甘油中，置于-70℃的冰箱中冻存。论文网

2。2。2  比较全细胞在纯水相体系和双水相体系中催化羰基还原反应

菌体的前处理：取冻存的菌体进行培养，先用接种环转接至固体培养基上，放入生化培养箱生长，2-3 d后长出小菌落，将其转接到发酵培养基放入摇床30 ℃、200 r/min培养36 h，之后用抽滤瓶抽滤，用生理盐水洗涤两次。

取4个50 mL圆底反应瓶，分别编号纯水相1、纯水相2、双水相1、双水相2。纯水相体系：分别加入2 g湿细胞、1 g葡萄糖、0。08 gCPMK,加pH6。5磷酸缓冲溶液配成20 mL体系；双水相体系：分别加入2 g湿细胞、1 g葡萄糖、0。08 gCPMK,加入由PEG4000(20%,w/w)/Na2HPO4(14%，w/w)组成的双水相溶液20 mL。

双水相配制方法(10 mL)：2 g PEG4000；1。4 gNa2HPO4；水6。6 g共10g,再加入0。3 g Na2HPO4调pH至6。0-7。0之间。体系配好后放摇床30 ℃、200 r/min反应48 h,然后用10 mL乙酸乙酯萃取，取上层萃取液放烘箱70 ℃烘干除去乙酸乙酯，再用1 mL异丙醇溶解剩余物，然后进行HPLC检测，计算反应 e。e。值和转化率。