利用冰晶核蛋白构建磷酸盐吸附蛋白大肠杆菌细胞表面展示体系(4)
(1)模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
(2)模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
(3)引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
表1 25μL PCR反应体系
反应液体系 实验组
（25μL体系） 阴性对照组
（25μL体系）
ddH2O 17.5 17.5
模板DNA 挑取单菌落JM109 0.0
上游引物（10μmol/L） 1.0 1.0
下游引物（10μmol/L） 1.0 1.0
10×扩增缓冲液 2.5 2.5
dNTP混合物（10mmol/L） 1 1.0
Taq酶（5U/μL） 0.5 0.5
Mg2+ 1.5 1.5
总体积 25 25
(1) 将反应管放入PCR仪中，按下列条件设好程序，进行PCR反应。
反应程序：94℃预变性5min
94℃变性1min
52℃退火1min 30个循环
72℃延伸2min
最后在72℃延伸10min
(2) 鉴定产物：PCR反应结束（大约3.5h）后，取5μL反应液用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳（用标准Marker: 200bp DNA Ladder），鉴定PCR扩增是否成功以及大小。
(3) 电泳验证产物后，扩大PCR反应体系至50μL（上述列表中的各项均×2）。
2.2.6琼脂糖凝胶电泳
制备0.8%琼脂糖凝胶：称取0.24g琼脂，溶于30ml 1×TAE中，微波溶解后静置，待温度冷却至双手可触摸时，加入1μL EB，倒入胶膜中冷却。
电泳条件选取：电压110V，电流30mA，时间30min。
2.2.7 T载体连接
取1μL T-Vector pMD19（simple），1μL所提phos片段和3μL去离子水，4℃冰箱中过夜连接。
2.2.8大肠杆菌感受态细胞的制备
（1）受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli MG1655单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600nm ＝0.5左右。
（2）感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) :将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
(3)转化: 加入pMD-19T-phos载体DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态。 将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
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