乳酸菌亚硝酸盐还原酶相关基因的研究(3)
亚硝酸还原酶是一类能还原亚硝酸盐的酶，其广泛存在于植物、藻类和细菌中。目前，国内外学者已经从分子结构和酶学性质等方面进行了深入的研究。
按照辅助因子和反应产物的不同可将亚硝酸还原酶分为四类：铜型亚硝酸还原酶（Cu-NiRs）；细胞色素cd1型亚硝酸还原酶（cd1NiRs）；多聚血红素c亚硝酸还原酶(cc NiRs)；铁氧化还原蛋白依赖的亚硝酸还原酶。
NiRs是胞内酶，其氧化还原反应过程中需要供体电子，且大多需要在厌氧条件下进行。因此体外检测NiRs时需要在密闭无氧且有电子供体的情况下才能进行检测。罗岩等[12]研究了细胞外测定巨大芽孢杆菌中的NiRs活性，探索了9种电子供体对NiRs的影响，并确定甲基紫精、连二亚硫酸钠和硫代硫酸钠作为电子供体，其中连二亚硫酸钠也起到隔氧的作用。在国内外文献报道中大多数以甲基紫精为电子供体，连二亚硫酸钠提供无氧环境，以反应前后亚硝酸盐的降解量为指标来检测NiRs酶活[13-16]。
现在在国外文献中一套使用PCR手段通过将特殊的亚硝酸盐还原酶基因片段扩增出来的寻找脱氮菌的方法被很大的发展。通过已知的亚硝酸还原酶基因的比对分析寻找扩增这些片段的引物序列。当用这些引物尝试扩增，属于在实验室中培养的已知亚硝酸还原酶类型的菌会被得到确认。同样的，这种方法可以测定五种实验室系的nir类型。[20-25]
1.2 检测nir基因的PCR法
一种系统被发展用于反硝化细菌的检测通过特殊的亚硝酸还原酶基因的片段的PCR扩增。引物序列被找到用来片段扩增来则两种亚硝酸还原酶（nirK和nirS）序列的比较分析。任何时候使用这些引物来进行扩增，已知的实验室中培养的脱氮nir基因类型可以被确认。同样的，这种方法可以确认五种实验室菌株的nir基因类型。Nir基因可以被从Blastobacter denitrificans, Alcaligenes xylosoxidans和Alcaligenes sp.三种菌种中扩增；nirS基因能被从Alcaligenes eutrophus DSM 530 和 反硝化隔离菌株IFAM 3698中扩增出来。对于两种基因，至少一个引物结合成功扩增所有测试株。特殊扩增产物不被从非反硝化菌或者携带其他nir类型基因的菌种扩增出来。扩增产物的特殊性通过随后的测序来得到确认。这些结果显示该方法在环境样品中的反硝化细菌的定性检测中的适用性。这被通过应用一次普通的引物结合扩增展示每一种nir基因在这个对于从水生生境获得的总DNA样品的研究中得到发展。[20-25]
1.3 氮代谢的调控研究进展
细菌代谢的有效性和适应性是众所周知的。他们进化出复杂的连锁的调控网络以应对几乎所有你能想象的任何环境条件为了能快速恰当地做出响应，细菌必须紧密检测必要影响的可利用性（比如碳源，碳源，磷，硫，微量元素，阳离子和阴离子）。细菌通过监测营养的胞外浓度，包内积累，以及包内的流动，把这些信号传递到调控蛋白以作出响应。[30]
氮源是细菌生存最重要的元素之一，氮源的有效吸收和同化是所有细菌共同的挑战。细菌进化出许多机制吸收各种各样的氮源。[31]氮源同化，吸收和无机氮源深入细胞代谢物，是几乎所有细菌的重要生理过程。不同氮源经过同化，形成细胞内重要氮素来源的两种氨基酸，即谷氨酰胺和谷氨酸，他们分别供应细胞内约25%和75%的氮素。铵几乎总是首选氮源，是氮源同化的检点，因为它能直接被同化成生物合成反应的关键氮素，也就是谷氨酰胺和谷氨酸[32]。 （图1-1）
图1-1 细胞内的氮循环中心反应和相关的酶[37]