水稻谷蛋白57H突变体Y236的遗传分析与基因定位(2)
高等植物在种子成熟过程中都合成大量的储藏蛋白，几乎占种子蛋白含量的80%。这些储藏蛋白在粗糙内质网上合成前驱体，然后被运输到液泡，并在那里转换为成熟形式。在ER核糖体上合成液泡型和分泌型两种蛋白，这两种蛋白从转移至ER内腔开始进入分泌系统。从ER转运至高尔基体，在此浓缩、修饰后被分别转移到细胞表面（分泌型蛋白）或者液泡中。液泡蛋白可能采用两种方式进行转运和贮藏，一是通过致密囊泡（dense vesicles, DVs）将蛋白转运至蛋白贮藏液泡（protein storage vacuole, PSV）；二是通过网格蛋白有被小泡（clathrin-coated vesicles, CCV）将蛋白转运至含有裂解酶的酸性液泡中[15]。水稻谷蛋白和醇溶蛋白同在ER表面合成，共翻译至ER内腔，但之后它们分选进入不同的亚细胞区室：醇溶蛋白直接留在ER内腔中，内质网以出芽的方式形成PBⅠ；而谷蛋白前驱体在内质网囊腔中剪切掉信号肤，并接受Bip（lumenal chaperon binding protein）、PDI（protein disulfide isomerase）等分子伴侣的辅助折叠形成正确的构象后，被转运至Golgi体并进一步进行加工修饰，缺省的情况下蛋白将通过网格蛋白有被小泡（CCV）被分泌到细胞膜外，但谷蛋白带有液泡分选信号，则通过致密囊泡,批量运输进入蛋白质储藏液泡（PSV），经液泡加工酶的特异剪切形成成熟的酸性和碱性亚基沉积，形成PBІІ[16]。
本研究的谷蛋白突变体材料Y236，是由宁粳1号经诱变得到的稳定遗传的突变体，通过突变体与Dular配组得到的F2群体进行基因定位，为Y236基因的进一步克隆奠定基础。
1 材料与方法
1．1 植物材料
Y236是一个从宁粳1号经诱变筛选得到的57H突变体。2017年春季在海南与其野生型宁粳1号正反交组合用于遗传分析，同时与已经完成测序的籼稻品种Dular配置杂交组合用于突变基因的图位克隆。水稻植株生长于海南陵水或江苏南京，种植于隔离条件良好的水稻种植条池内。
1．2 实验方法
1．2．1 表型鉴定
在灯箱下观察该突变体的异常表型，取野生型、突变体发育12DAF胚乳，采用2.5%戊二醛（0.1M pH7.0）4度固定12h后，送生命科学实验中心进行后续处理，采用Power Tome XL超薄切片机切片，采用H-7650透射电子显微镜观察。
1．2．2 SDS-PAGE分离种子蛋白
试剂配制：
（1）300:8丙烯酰胺贮存液（30.8%）：
甲叉双丙烯酰胺 8g，
丙烯酰胺 300g，
ddH2O溶解后定容至1000mL，滤纸过滤，4℃保存。
（2）1M Tris-HCl缓冲液：
Tris 121.14g，
ddH2O溶解并用浓盐酸分别调节pH值到6.8或8.8，定容至1000mL，4℃保存。
（3）10% SDS：
SDS 10g，
ddH2O溶解充分后定容至100mL，室温保存。
（4）10%过硫酸铵（APs）：
过硫酸铵 10g，
ddH2O充分溶解后定容至100mL，分装后-20℃冻存。
（5）10×电泳缓冲液：
甘氨酸 144.2g，
Tris 30.3g，
SDS 10g，
ddH2O充分溶解后定容至1000mL，室温保存。
（6）SDS-PAGE染色液：
异丙醇 250mL，
冰醋酸 100mL，
1g考马斯亮蓝R/G-250，