筛选酿酒酵母中与Dsl1复合体亚基互作的细胞自噬相关蛋白(3)
图1-2 Dsl1复合体与内质网SNARE蛋白Use1和Sec20的相互作用将高尔基体逆行运输囊泡栓留到内质网的示意图模型[17]
Figure 1-2 Schematic model for the tethering of Golgi-derived retrograde trafficking vesicles to the ER via attachment of the Dsl1p complex to the ER SNAREs Use1 and Sec20
运输囊泡在与受体膜的融合及释放货物的过程中，栓留起着重要作用；并且囊泡运输的起点在内质网上，因此，与内质网相关的拴留在研究中十分重要[14]。酿酒酵母中Dsl1复合体在高尔基体到内质网的逆行运输中发挥作用[12]。目前，Dsl1复合体与衣被复合体相互作用驱动去包被的机制以及有关Dsl3在拴留中的具体功能都还不很清楚，还需进一步的探究。
综上所述，在酿酒酵母中，Dsl1复合体可能直接或间接参与自噬的过程，但它们参与细胞自噬的调控机制并不清楚。因此，我们需要验证Dsl1复合体是如何参与细胞自噬的调控。然后根据上述实验的结果，我们将可以进一步地探讨Dsl1复合体亚基参与调控细胞自噬的分子机制。有研究已报道，参与细胞自噬形成的Atg蛋白有五种功能单元组成：Atg1/ULK复合体、III型PI3K（Phosphoinositide 3-kinase）复合体、Atg9、Atg2-Atg18复合体、Atg12-Atg5-Atg16和Atg8/LC3-PE两类泛素结合系统[18]，我们将通过检测Dsl1复合体与这几类细胞自噬相关蛋白中的一种或几种的相互作用来调控细胞自噬的，进而阐明Dsl1复合体参与细胞自噬的分子机制。
1 材料与方法
1．1 菌株与质粒
1．1．1 酵母菌株
表1 本研究所需酵母菌株
1．1．2 质粒
表2 本研究所需质粒
1．2 酵母总DNA的提取
1） 将本研究所需的野生型酵母菌菌株从菌株总库中取出，在营养丰富的YPD固体培养基上划线，并将平板倒置放于26℃恒温水浴培养箱中培养活化3天左右；
2） 从以上YPD固体培养基上挑取单菌落于含有2 ml YPD液体培养基的试管中，放于26℃旋转培养箱中，培养12 h左右至OD600为1左右；
3） 取步骤2）中培养的菌液1.2 ml到1.5 ml离心管中，13200 rpm离心1 min，除去上清。
4） 加入100 μl的酵母菌裂解液，涡旋混合均匀；
5） 在通风橱中向离心管中加入100 μl的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液（25:24:1）和180 μl的无菌玻璃珠，涡旋仪上2400 rpm，破碎4 min。然后，低温13000 rpm 高速离心4 min；
6） 转移上清至新的1.5 ml无菌离心管中，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，置于-20℃冰箱沉淀20 min，13000 rpm离心8 min，去上清；
7） 加0.8 ml 70%的乙醇，上下颠倒，13000 rpm离心5 min，去上清；
8） 常温放置20 min左右，直到没有酒精，然后加入30~60 μl的无菌水来溶解DNA，-20℃保藏待用。
1．3 质粒的提取
1） 将含有pACT2质粒的大肠杆菌划线于LB+Amp固体培养基平板上，然后倒置放于37℃恒温培养箱中过夜培养；
2） 提质粒。提取质粒的方法按照质粒小量制备试剂盒说明书操作，步骤见附录三。
1．4 DSL1,DSL3和TIP20的克隆
1．4．1 高保真酶扩增目的基因片段
利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计相应的引物，本实验克隆所需的上下游引物如表3所示：
表3 本研究所需引物
实验室使用宝生物工程公司的PrimeSTAR来扩增目的基因，反应体系如下：
反应程序设定：
取2 μl 的PCR产物与8 μl 2×Loading Buffer混合后进行电泳跑胶检测，如果条带单一、片段大小和目的基因的大小基本一致并且亮度足够，则可以对PCR产物进行纯化，将纯化后的PCR产物-20℃保藏。纯化采用DNA纯化试剂盒（见附录三）。