蛋白质能直观、全面反映生物体的各种功能和作用机制,在生命代谢和调控途径中作为主要执行者存在。蛋白标志物是疾病标志物(也称生物标志物,Biomarker)的一种,由于蛋白质是大多数药物和致病因子的靶分子,在疾病中蛋白标志物可作为一个特征性的生化指标[12]。在蛋白标志物筛选中,SELDI-TOF-MS(surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,表面加强激光解析电离飞行时间质谱)技术是目前蛋白质组学主要应用的技术之一,可用于观察病人体液中蛋白质的动态变化,其原理是利用激光照射样本使样本离子化,可在电场中飞行,不同质荷比(m/z)的离子到达检测器的时间也不同,分子量越小,离子飞行时间越短,反之则长。据此获得数据,通过仪器分析绘制得到蛋白质谱图,再经软件分析所得处理过的数据,可得到所需的蛋白峰,最后用生物信息学比较处理,得到各项数据。SELDI-TOF-MS技术具有操作简便,具有可使用少量原始样本,检测快速,重复性好,高通量的特点[13,14]。

在此技术基础上发展而来的纳米磁珠结合SELDI-TOF-MS技术又称液体芯片-飞行时间质谱技术。应用此技术在肿瘤血清差异蛋白筛选研究中[15],筛选获得了一些特异性和敏感性都较高的蛋白标志物,为研究疾病标志物提供了新的方法,显示了该技术广阔的应用前景。

本研究中选取不同控制水平的哮喘儿童为研究对象,取患儿血清做样本,采用纳米磁珠结合SELDI-TOF-MS技术建立蛋白质图谱,将所得的蛋白质图谱进行统计对比,寻找差异蛋白峰,研究这不同控制水平的哮喘儿童血清蛋白的表达差异性,以期寻找儿童哮喘不同控制水平的标志性蛋白。

2 材料与方法

2。1 实验材料

2。1。1病例诊断分组

儿童哮喘诊断标准:参照中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的儿童哮喘诊断标准。按GINA方案(2009)评估哮喘控制水平,借助C-ACT问卷测试建立两种不同病情控制水平的儿童哮喘组:儿童哮喘完全控制组和儿童哮喘未控制组。收集两种哮喘控制水平的儿童哮喘样本45例,年龄范围在4-12岁。

2。1。2样本收集

抽取3 mL儿童哮喘完全控制组和儿童哮喘未控制组患者的周围静脉全血样本,抽血时间需在凌晨5-7时,空腹状态下。然后将存放样本的采血管立即转移到4℃环境下垂直放置1-2 h,使血液凝结,再以4℃、4000 g离心10 min,将上层血清分装在0。5 mL离心管中,每管30 µl,置于-80℃冰箱备用(注:避免反复冻融)。样本编号要与病历资料对应,并建立病历资料库。

2。1。3试剂和耗材论文网

2。1。3。1试剂

碘乙酞胺(IAM)购自德国Apphchem公司;二硫苏糖醇(DTT)购自美国Sigma-Aldrich公司;色谱级纯度乙腈(ACN)、色谱级纯度甲酸(FA)、色谱级纯度甲醇、色谱级纯度水均购自美国J。 T。 Baker公司;芥子酸 (SA)购自美国Ciphergen公司;尿素(Urea),3-环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)购自美国Promega公司;乙酸钠购自上海生工生程公司;三氟乙酸(TFA)购自瑞士Fluka公司;HEPES购自美国Sigma-Aldrich公司;All-in-one protein standard II购自美国Bio-Rad公司;Monoisotopic、Cytochrome C、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)购自美国Sigma-Aldrich公司。

2。1。3。2耗材

WCX磁珠,CM10芯片购自北京SED Science & Technology公司;磁性分离板购自美国Ciphergen公司;PCR,96孔板及封口膜购自美国Axygen公司;塑料离心管(0。2 mL、0。6 mL、1。5 mL、2。5 mL)购自美国Axygen公司;10 mL采血管购自美国BD公司;Au芯片购自美国Ciphergen公司。

2。1。4缓冲液及溶液配制 

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