2。1。4。1 U9溶液(9 M尿素,2 % CHAPS,1 % DTT) 

    用电子天平称取2。70 g尿素,加入至盛有3 mL的HPLC H2O的烧杯中,加热使其充分溶解(注:加热温度不能超过37℃),再将称取好的0。1 g CHAPS加入溶液中,充分溶解后转移到容量瓶中,用HPLC H2O定容至4。5 mL,然后加入0。05 g DTT,定容至5 mL。将配制好的溶液各取100 µl装到500 µl的离心管中,并用封口膜封好放置-80℃冰箱中备用(注:不能反复冻融)。

2。1。4。2 WCX-2缓冲液 (50 mM NaAC,PH 4。0)   

    电子天平称取0。82 g无水乙酸钠,放入180 mL HPLC H2O中,搅拌使其充分溶解,滴加HCL调节溶液PH至4。0。将调节好PH的溶液用玻璃棒转移至200 mL容量瓶中,定容。放置4℃冰箱内备用。

2。1。4。3 1% TFA溶液 

    移液枪取10 µl TFA到离心管内,再加入990 µl的HPLC H2O,吹打混匀,盖上盖子密封,裹上锡纸放置于4℃环境中避光保存(注:有效期为5天)。

2。1。4。4 SPA饱和溶液 

    吸取80 µl ACN加入有80 µl 1% TFA溶液的离心管中混匀,后加到SPA分装管中,再放到旋涡混合器中进行充分混匀,时间约3 min。取出,室温下静置5 min,再放到离心机中10000 rpm离心5 min。吸取上清液到新的离心管中备用(注:此溶液应即配即用)。

2。1。4。5 CHCA基质溶液 

    电子天平称取CHCA 4 mg,加入盛有1 mL 60% ACN/0。1% TFA的离心管中,振荡使其充分溶解,后放到离心机中10000 g离心2 min,取上清液到新的离心管中备用。

2。1。5 主要仪器

生物安全柜购自美国Forma公司;超净工作台购自苏州净化设备有限公司;冷冻高速离心机2K15C购自美国Sigma-Aldrich公司;高压灭菌锅MLS-3750型购自日本SANYO公司;SELDI-TOF MS (model PBS II-c)购自美国Ciphergen Biosystems公司;Milli-Q纯净水系统购自德国Millipore公司; 电热恒温水浴槽购自江苏海门公司、常温高速离心机购自美国Eppendorf公司、恒温振荡器购自江苏太仓科教器材厂、电子天平购自上海精科天平厂、PH计购自瑞士METTLER TOLEDO公司。文献综述

2。2方法

2。2。1血清样品处理

  血清样品处理方法:将血清样品从-80℃中取出,置冰盒上融解以4000 g,4℃离心2 min。再取10 µl血清加20 µl U9溶液混合孵育30 min后,加入370 µl WCX-2缓冲液稀释(血清最终上样量为2。5 µl)。

2。2。2WCX磁珠处理血清

2。2。2。1WCX纳米磁珠活化

WCX磁珠处理血清可按说明书进行  取50 µl WCX纳米磁珠加入200 µl PCR管,放置磁性分离板上孵育1 min(注意避免由于孵育时间过长导致磁珠结块),后吸除上清液。在PCR管加入100 µl WCX-2缓冲液洗脱5 min,然后放置磁铁上孵育1 min,吸除上清液,此步骤进行2遍,保证磁珠的活化。再吸取100 µl经过处理的血清样品加入到PCR管中吸打混匀(注意避免产生气泡)。

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