（3） 用发根农杆菌k599介导的方式侵染大豆根，从而得到大豆阳性转基因[8]

    农杆菌转化技术目前也已广泛应用于大豆耐盐性[11]研究中，在大豆叶片(叶盘法)、子叶、子叶节、下胚轴等都可以作为农杆菌转化的外植体，克隆转录因子GmMYB130目的片段通过酶连接到表达载体pDL28DHA，将构建好的载体转化到农杆菌中，农杆菌可以通过侵染外植体的方法将转录因子GmMYB130与植物建立联系。

（4） 使用体式荧光显微镜，红色荧光场下筛选阳性根，切除非阳性转基因根。 

1．材料、仪器设备及试剂

1。1 实验材料 

Union85140盐敏感大豆。由中国农科院作物科学研究所邱丽娟研究员惠赠，并在杭州师范大学下沙生科院光照培养间中种植。大肠杆菌（Escherichia coil）取自本实验室保存的菌种DH5α，RFP载体、T载体、表达载体pDL28-HA、发根农杆菌k599。

1。2 实验试剂

酵母提取物、蛋白胨、Agar、牛肉浸膏、酵母浸膏、蔗糖、氯化钠、硫酸镁、Amp、Kan、X-Gal、IPTG、液氮、三氯甲烷、异丙醇、Buffer RW1 和Buffer RW2、Buffer RL + β-巯基乙醇（100:1）、康为世纪RNApure Plant Kit（DNase I）、康为世纪HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit HiFiScript cDNA 第一条链合成试剂盒cw2569、限制性内切酶、T4 DNA polymerase 购于 TARAKA； NaCl 购自上海生工；酵母提取物 Yeast Extract； Agar B 购于生工； 琼脂糖购于 BIOWEST；DNA Marker购于 BIOMED；High Pure PCR Product Purification Kit；质粒抽提 QIAprep Spin Miniprep Kit 购于 QIAGEN。

1。3 仪器设备   论文网

摇床（New Brunswick Scientific）、单人净化工作台（苏州净化 SW-CJ-ID 型）、电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏 DHG-9123A 型）、高速离心机（Eppendorf centrifuge5418）、高速台式冷冻离心机（Eppendorf centrifuge5810R）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、PCR 仪（Applied Biosysterms 2720Thermal Cycler&Long Gene A200Gradient Thermal cycler）、电热恒温振荡水槽（上海森信 DKZ-450B 型）、荧光定量 PCR 仪（AppliedBiosysterms StepOnePlus）、电泳仪（Amersham Biosciences EPS601）、-20℃低温冰箱（Electrolux BCD-235F）、-80℃低温冰箱(SANYO MDF-U32V)。

1。4 培养基

1）FM培养基：FM液/L+12g琼脂/L；

2）FM液：A溶液1000 X（MnSO4·7H2O，24。64 g/200ml）、B溶液1000 X （KH2PO4，19。06 g/200ml）、C溶液500 X（NaH2PO4·7H2O）、D溶液400X（FeSO4·7H2O，1。12 g/200ml；Na2EDTA，1。48 g/200ml），E溶液1000 X（CaCl2·2H2O），F溶液1000 X（MnSO4、CuSO4、H3BO3、NaMoO4五种药品先分别称取0。5 g溶解，之后混匀在1 L水中，从中取出1 mL稀释1000倍备用。ABCDEF六种混合液按一定比例的混合的集合；

3）LB固体培养基：酵母提取物20 g/L，琼脂12~15 g/L，高温灭菌；

4）FM生根培养基1 L：FM+15 g蔗糖+12 g琼脂+双蒸水定容；

5）63号培养基：蔗糖10 g/L、K2HPO4g/L、NaCl 0。1 g/L、酵母提取物1 g/L、MnSO4·7H2O 0。2 g/L、MnSO4 1 ml/L、H3BO4 1ml/L、NaMoO4 1 ml/L、柠檬酸铁1 ml/L、CaSO4·2H2O 1 ml/L；

6）SOC培养基g/L：一蛋白胨20 g，酵母浸粉5 g，氯化钠0。5 g，氯化钾0。186 g，氯化镁0。95 g，硫酸镁1。2 g，葡萄糖3。6 g，pH值7。0±0。2；

1。5 PCR扩增引物

PDL28-MYB 130HA-F：    CGGGATCCATGGGTGCTCCTAAGCAGAAATG          Tm=62。5℃

PDL28-MYB 130HA-R：   GCGTCGACAATACGAAGTGTCTTGCATTTTAGTGC        Tm=62。9℃