肺炎克雷伯杆菌噬菌体的分离及受体的鉴定(3)
0.01%明胶，121℃ 灭菌15 min 后 4℃保存备用。 （5）双层琼脂培养基：
上层培养基：0.7%半固体 LB培养基
下层培养基：1.5%固体 LB培养基
每次倒上层板时，加入 60 μL的肺炎克雷伯杆菌于 3 mL 0.7%的半固体 LB培养基。
该培养基用于噬菌体的分离纯化以及宿主谱等的测定实验。
（6）三抗 LB培养基：
Amp100Sm100Km50+LB 液体/（半）固体培养基： LB 液体/固体培养基+氨苄青霉素
储存浓度100 mg/mL，使用浓度100 μg/mL；链霉素储存浓度 100 mg/mL，使用浓度100
μg/mL，卡那霉素储存浓度 50 mg/mL，使用浓度 50 μg/mL，用于生物学特性研究等实
验。
Amp100Sm200Km50+LB 液体/（半）固体培养基：LB液体/固体培养基+氨苄青霉素储
存浓度 100 mg/mL，使用浓度 100 μg/mL；链霉素储存浓度 200 mg/mL，使用浓度 200
μg/mL，卡那霉素储存浓度50 mg/mL，使用浓度 50 μg/mL，用于筛选受体的实验。
（7）提 DNA主要试剂：
溶液 Ι： 50 mM 葡萄糖，25 mM Tris-HCl(pH 8.0)，10 mM EDTA(pH 8.0）
溶液 ΙΙ：NaOH 1 mL，10% SDS 1 mL，加 ddH2O至10 mL。使用前临时配置。
溶液 ΙΙΙ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5 M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加
ddH2O至 500mL。4℃保存备用。
TE：10 mM Tris-HCl（pH 8.0） ，1 mM EDTA（pH 8.0） 。1 M Tris-HCl（pH 8.0）1
mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）0.2 mL，加ddH2O至100mL。121 ℃ 灭菌 15 min 后4℃保
存备用。
1.1.3 污水样品
污水样品采自南京农业大学西门生活污水。
1.2 实验方法
1.2.1噬菌体的分离与纯化
（1）宿主菌的准备
将 24 株冻存的肺炎克雷伯杆菌复苏后，在固体琼脂平板上分区划线，置于 37℃培
养箱培养过夜，传代直到菌株状态良好后挑取单一菌落，接种于 LB 液体培养基， 于37℃
摇床振荡培养到细菌的对数生长期。
（2）水样处理
取未进行处理的南京农业大学西门生活污水原液 400 mL，加入 CaCl2固体后使得终
浓度为 1 mmol/L，在 4℃的条件下 10，000 rpm × 5 min离心，保留上清液，除去沉淀
待用[7]。
（3）噬菌体分离
取保留的上清液 200 mL 于锥形瓶中，加入 24 株肺炎克雷伯杆菌的菌悬液各 1mL
和 LB 液体培养基 50 mL，置于 37℃摇床振荡培养 12~16 h。次日，在 4℃的条件下，
8000 rpm×2min 离心沉淀细菌，取上清用 0.45 μm 过滤除菌后，再用 0.22 μm 过滤器再
次过滤后，取过滤最后一次含噬菌体的液体 20 μL至试管液体培养基中 37℃培养过夜，
观察试管中若含杂菌，则需进行再一次过滤。
（4）纯化
为了分离到形状相近、大小比较均一的噬菌斑，需要进行进一步纯化，本实验用双
层琼脂平板法纯化。先将双层琼脂培养基平板置于 42℃培养1~2 h后，再用灭菌后的牙
签蘸取倍比稀释后的噬菌体菌液进行分区划线，42℃培养5~6 h后观察噬菌斑形成情况
[8]。重复此纯化过程 3~4次，即可获得形状相近、大小比较均一的噬菌斑。