平沙绿僵菌NJMp2103的杀虫谱测定(2)
1 材料与方法
1.1实验材料
本实验所使用的绿僵菌为从田间采回的病死僵虫中分离纯化得到的。
1．1．1 供试菌株的研究与培养
将采回的病死僵虫挑选后消毒后分解，放入盛有PDA的培养基中进行培养2-3d，观察其生长形态，从中挑选出不同部分菌落。对挑选菌落进行分离，避免挑到腐生真菌与细菌（腐生真菌一般不具备致死稻飞虱的毒力），挑选出的真菌在培养箱中培养2-3d后进一步纯化，直至每个培养皿中只有一种菌为止。
对分离培养出的真菌进行DNA鉴定，采用 CTAB法提真菌基因组DNA。首先取小块菌体，在100mL锥形瓶中摇菌，25℃，200r/min，大于24h。挑取适当大小的菌丝团过滤，用吸水纸压干后，放入匀浆器中，液氮研磨（加CTAB研磨）。将菌丝粉末置于2mL离心管中，加入2%CTAB提取液700—800μL，80μLSDS，涡旋混匀，于60℃水浴锅中水浴30min，期间每隔10min上下颠倒一次，混匀。加入等体积CIA氯仿/异戊醇（24:1），摇床上200r/min，20min。离心机中13000rpm，5min，吸(DNA在上清中)上清（约700μL），加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀。离心机13000rpm，5min，吸上清（约700μL），加等体积CIA，混匀。离心机13000rpm，5min，吸上清（约700μL），加2倍体积无水乙醇沉淀，-20℃，30min以上。离心机13000rpm，5min，移除上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，吹干；加100μLdd水溶解沉淀，20μg/mL RNase（1-2μL），37℃消解大于20min后，-20℃保存备用。使用ITS4-ITS5引物对其进行PCR扩增，并获得其目的条带进行回收将回收的核算送于南京金斯瑞公司进行测序，在NCBI上进行Blast序列比对。
对分离纯化得到的真菌我们前期已进行相关的毒力测定，并证实其对某些昆虫具有较高的毒力，将其挑选出来后进行杀虫谱的测定。
1．1．2 供试昆虫
本实验的所有供试昆虫均为周边实验室提供的常年实验室室内饲养的敏感品系。本实验采用的供试昆虫有双翅目蚊科，鳞翅目二化螟，半翅目中黑盲蝽。
1．2 试验方法
培养供试真菌大量繁殖产孢，将吐温-80溶液加入纯水配成0.05%的吐温-80纯水溶液，用配好的0.05%的吐温-80纯水溶液冲洗培养皿2-3次，将孢子从培养皿中洗下来，将孢子液转移至大离心管中，加入玻璃珠在涡旋混匀器上混匀，使孢子被充分打散后，用0.05%的吐温-80纯水溶液按浓度梯度稀释,用血球计数板计算每毫升的真菌孢子含量，将其稀释成1×108孢子/mL。
双翅目淡色暗蚊以幼虫为供试虫体，在生测杯中加入70mL左右1×108孢子/mL的孢子液，后接入30-40头幼虫，在培养箱中25℃光照16:8（光照：黑暗）条件下培养。每日统计死亡幼虫数，并在生物测定最后一天进行活虫数的统计。设置三组每组三个重复，并用0.05%吐温-80纯水溶液饲养的淡色暗蚊幼虫作为对照组。
鳞翅目二化螟以3-4龄幼虫为供试虫体，在实测杯中铺入一层卫生纸，浸湿后撒上水稻种子，待水稻生长至1-2cm左右时接入15头幼虫，用手持喷雾器均匀喷洒1×108孢子/mL的孢子液0.35mL于生测杯中的供试虫体上，生测杯用黑布盖住杯口防止供试昆虫由于趋光性逃出生测杯。在培养箱中25℃光照16:8（光照：黑暗）条件下培养。每日统计死亡数量，与生物测定最后一天统计活虫数，设置三组每组三个重复，并以用手持喷雾器均匀喷洒0.05%吐温-80纯水溶液0,35mL的中黑盲蝽作为对照组。
半翅目中黑盲蝽以若虫为供试虫体，饲养中黑盲蝽的饲料为市场上购入的玉米和四季豆，为了排除饲料的农药残留，先将购入的玉米和四季豆用碳酸氢钠溶液消毒20min，再用清水冲洗晾干后放入生测杯中接入供试中黑盲蝽15头，用纱布盖住生测杯口，防止供试中黑盲蝽逃出。在培养箱中25℃光照16:8（光照：黑暗）条件下培养。每日统计死亡数量，并于生物测定的最后一天统计活虫数，设置三组每组三个重复，并以用手持喷雾器均匀喷洒0.05%吐温-80纯水溶液0,35mL的中黑盲蝽作为对照组。
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