λ-Red 重组又称ET重组,是利用λ噬菌体Red 重组酶将导入细胞的线性DNA 片段与染色体( 或载体)的特定靶序列进行同源重组[5]。入Red区段包括3个基因:bet、exo和gam。Exo是核酸外切酶,bet编码的B蛋白,,Gam为 16 kD的多肽分子,在Red 同源重组过程中起着决定性的作用[6]。其一种方法是将λ-Red 基因克隆到低拷贝质粒,在诱导型启动子控制下适量表达。包含ParaB 启动子和exo、gam和bet三种基因片段的质粒由于质粒上具有核糖体结合位点,在阿拉伯糖诱导下Red 蛋白可以有效的转录表达,同时它还是一个温度敏感型复制子,当实验中不需要时可以不让其表达[7]。

转录信使RNA(tmRNA)是一个小的稳定的RNA分子,通常也被称作SsrA或10Sa RNAl31,由ssrA基因编码。转录信使RNA,小蛋白B介导的反式翻译是细菌的翻译质量控制系统。该系统可以直接修饰和降解一些蛋白质,这些蛋白质的生物合成停顿或被阻断,从而该系统可以拯救核糖体,这些核糖体滞留在3’端缺失终止密码子的mRNAs序列上[8]。

本研究以自行分离的E1为研究对象,对其基因ssrA进行突变,构建ssrA基因的突变株,进而为后续研究ssrA基因与APEC致病性之间的关系创造条件。 

2。 材料与方法

2。1 材料

2。1。1 菌株和质粒  论文网

质粒pKD3母液购于优宝生物生物公司,大肠杆菌感受态细胞(Escherichia  coli DH5a)、大肠杆菌E1野生株均由实验室冷冻保存。

2。1。2 试剂与耗材

PCR引物由赛百盛基因技术有限公司合成,T4 DNA Ligase(350U/μL)、PMD18-T Vector (50ng/μL)、10×T4 DNA Ligase Buffer均购于宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa);dNTPs(2。5mM)、DL5000 DNA Marker、Taq DNA Polymerase(5U/μL)、10×Taq酶反应缓冲剂购于北京佳兰生物科技有限公司;LB固体培养基、LB液体培养基;氨苄青霉素(100mg/mL) 氯霉素(25mg/mL),自己制备。

LB液体培养基:NaCl 2g 胰蛋白胨 2g 酵母粉 1g  加纯水定容至200mL

LB固体培养基:NaCl 2g 胰蛋白胨 2g 酵母粉 1g  琼脂3g 加纯水定容至200mL

提质粒P1:1M Tris-HCl(pH8。0)25mL  20% Glucose(1。11M) 45mL

          0。5M EDTA(pH8。0)20mL    dH20  910mL

          高压灭菌后4℃保存,每50mL加2mL的RNaseA(20mg/mL)

提质粒P2:10%SDS  50mL   2N NaOH   50mL   加灭菌水定容至500mL

提质粒P3:KOAc    147g   CH3COOH   57。5mL  加去离子水定容至500mL

         高压灭菌后4℃保存

2。1。3 仪器设备

PCR扩增仪(型号:GeneAmp®PCR System 9700)、无菌操作台、离心机、恒温水浴箱、纯水系统、微量移液器、天平、电泳槽、电泳仪、紫外凝胶成像系统、电转化仪。

2。2 方法

2。2。1 质粒pMD-T-ssrA::Cat片段的获得

2。2。1。1 pKD3质粒的提取

在超净工作台中,将3µLpKD3宿主菌的母液加入1mL含有Cat(终浓度25µL/mL)抗生素的LB液体培养基的EP管中,37℃,180rpm,振摇避光培养过夜。

次日,EP管中应呈现浑浊。将过夜培养物三区划线,接种于含有Cat抗生素的LB平板上。37℃,避光培养12h后,挑取2~3个抗性单菌落接种于1mL含有Cat抗生素的LB液体培养基的EP管中,37℃,180rpm,振摇避光培养过夜。

EP管中应呈现浑浊,为获得pKD3的质粒,对隔夜摇床培养物用碱裂解法进行质粒的提取。

碱裂解法提取质粒步骤:

① 将隔夜摇床培养物在离心机中,9000rpm,离心1min文献综述

上一篇:水稻种子分子特征数据库构建
下一篇:马铃薯生淀粉糖化酶生产菌筛选发酵优化及酶学性质研究

重组菌的诱导培养表达及...

羟基腈裂解酶在大肠杆菌...

重组鼠李糖苷酶的表面展...

重组巴斯德毕赤酵母产内...

重组马克斯克鲁维酵母产...

硫酸粘杆菌素处理重组大...

重组马克斯克鲁维酵母产菊粉酶发酵条件优化

小學语文教學中對话”活...

家庭生活中的电动开瓶器设计分析

团体社会工作对大学新生适应性影响研究

三胎休假政策,超生三胎...

高考改革后高中物理的教学方法研究

新视角下高校禁烟管理策略研究【2648字】

南京大学行政办公楼建筑结构设计任务书

灌注桩东亭花园住宅小区...

SWOT分析的珠海港集装箱运...

浅析粉丝营销策略