韧皮部阻断如果要作为一种技术运用到科学研究中,其作用效果以及其效果的时限性、稳定性均需要达到一定水平。本试验在对阻断方法进行改进之后,对改进后的处理结果进行了分析,以期来论证该方法在实际研究中的可靠性和可利用性。
1  材料与方法
1.1  试验设计
在南京农业大学牌楼试验站塑料遮雨棚棚中,盆栽种植高温敏感性棉花品种(苏棉15)和耐高温棉花品种(PHY370WR),自然温度下培养至第4-5果枝第一果节蕾开花,于开花当日挂牌标记当日所开白花及其棉铃对位叶。选用三氯乙酸(TCA)作为阻断剂,设置不同的浓度(5%、10%、15%、20%、25%、30%),分别在上午9时左右和傍晚18时左右对不同花后天数的棉铃对位叶叶柄进行涂抹处理。次日观察处理后叶片的外观,并测定其净光合速率和SPAD值,明确韧皮部阻断的最适浓度及最佳处理时间。
通过对花后15天棉铃对位叶韧皮部进行最优实验条件下的阻断处理后,测定阻断后叶片内相关物质的含量。同时,采用含有13C标记的二氧化碳饲喂相应叶片,一小时后取样保存,用于测定其13C的丰度。通过分析叶片中可溶性糖/蔗糖/淀粉的含量水平与未阻断处理叶片之间的变化,结合阻断处理和对照间13C的差异,计算阻断处理对光合产物的阻断效果。结合其他手段,明确该实验条件下对韧皮部运输的阻断效果。
1.2  测定内容和方法
1.2.1  净光合速率和SPAD值的测定   
1.2.2  棉铃对位叶中蔗糖和淀粉含量的测定    取烘干棉铃对位叶0.1 g放入10 mL离心管中,加5 mL 80%酒精后80oC提取30 min,然后在67 g离心5 min,将上清液倾入25 mL容量瓶。重复提取两次,收集上清液于容量瓶。合并离心液于25 mL容量瓶中用蒸馏水定容,用间苯二酚显色法测定样品中蔗糖含量。
向提完糖的沉淀中加水2 mL。搅拌均匀,至于80oC水浴中使残留的乙醇蒸发,再放入沸水浴中糊化15 min,冷却后,将离心管放入冰水浴中,加入2 mL冷的9.2 mol L–1高氯酸,不时搅拌,提取15 min后加水4 mL。混匀离心10 min,上清倾入25 mL容量瓶。再向沉淀中加入2 mL 4.6 mol L–1高氯酸,搅拌提取15 min后加水6 mL,混匀离心10 min,收集上清液于容量瓶。然后用水洗沉淀1-2次,离心,合并离心液于50 mL容量瓶中用蒸馏水定容后,采用硫酸蒽酮显色法测定样品中淀粉含量。
1.2.3  13C丰度的测定    对标记叶片进行含13C的二氧化碳气体饲喂,一小时后将部分叶片取下保存,作为对照。次日将其余部分叶片取下,采用元素分析仪—同位素质谱仪(EA—IRMS)联用技术,测定13C丰度。
1.2.4  数据处理与分析    采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理及作图,用SPSS 11.0统计分析软件进行方差分析。采用LSR法进行差异显著性比较,显著性水平设定为 α =0.05。
2  结果与分析
2.1  阻断效果随阻断处理时长的变化
叶柄韧皮部阻断在阻断当天对相对应叶片的净光合速率影响不明显,但在阻断处理的次日,叶片净光合速率会极显著的降低,5天的动态测定结果如图1。从图中可以看出在处理后1天,其数据最为集中离散程度最小,2天后净光合速率降至最小。离散程度随时间增加不断增加。综合阻断后净光合速率的下降幅度和数据的离散性可以确定,阻断1天后进行试验取样最具有代表性。
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