5×Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液):称量Tris15.1 g,Glycine 94g,SDS 5.0 g加入约800 mL去离子水,溶解后,补足水定容至1L,室温保存。
2×SDS loading buffer:将1mol/L Tris-HCl(pH 6.8)1mL,10% SDS 4mL,0.02g溴酚蓝,甘油2mL,250 μL β-巯基乙醇,最后加入去离子水定容至10 mL。
考马斯亮蓝R-250染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,量取250 mL异丙醇,100 mL冰乙酸,加入约650 mL去离子水,搅拌均匀后用滤纸除去颗粒物质,室温储存备用。
考马斯亮蓝染色脱色液:量取冰乙酸100 mL,乙醇100 mL,按1比1混合,加去离子水定容至1L,充分混合后使用。
无K+PBS:19mL0.2mo1/LNaH2PO4和81mL0.2mo1/LNa2HPO4混匀后加入约900mL去离子水,定容到1L。
0.1mol/L NaOH:称取NaOH 0.8g,加入150mL的去离子水中,待其溶解后,定容到200mL常温保存备用。
0.1mol/L HCl:需要在通风橱中配置该试剂,取0.9mL浓盐酸,加入90mL的去离子水中,定容到100mL常温保存备用。
蛋白纯化需要用到的试剂
包涵体Binding Buffer:首先称取 Urea 240 g,NaCl 14.6 g,咪唑 0.68 g,倒入烧杯中,再加入50 mL的无K+PBS,搅拌溶解,最后加去离子水定容至500 mL,用0.22 µm滤膜抽滤,过滤掉其中的细菌和杂质,室温下保存备用。
包涵体Elution Buffer:首先称取 Urea 240 g,NaCl 14.6 g,咪唑17 g,倒入烧杯中,再加入50 mL的无K+PBS,最后加去离子水定容至500 mL,调节pH至7.4,用0.22 µm滤膜抽滤,过滤掉此中的细菌和杂质,室温保存。
上清Binding Buffer:包涵体Binding Buffer不加Urea,其他相同。
上清Elution Buffer:包涵体Elution Buffer不加Urea,其余相同。
1. 1. 4 仪器设备
    超净工作台;低速大容量离心机(无锡瑞江离心机厂);高速大容量低温离心机(Beckman);立式自动电热压力蒸汽灭菌器;2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL的移液枪(GILSON公司);两台PCR扩增仪(HYBAID公司);核酸胶电泳仪(DYY-11B,北京市优尔一仪器厂);恒温振荡器,用于摇菌(江苏太仓实验设备厂);隔水式恒温培养箱,(上海森信实验设备有限公司);超声破碎仪(南京先欧生物技术公司);涡旋震荡机;电热恒温水槽(DK-8D,上海森信实验仪器有限公司);常温离心机和冷冻离心机(Eppendorf);蛋白胶电泳仪(Bio-Rad);凝胶成相仪(BIO-RAD)。
1.    2  1A蛋白基因的PCR克隆
 根据GenBank中和缓艾美耳球虫1A基因序列,应用Primier 5.0软件进行设计1A基因的扩增引物,设计出来的引物P1和P2的5ˊ端分别含BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点。引物送至江苏省琴科生物有限公司合成。
以所得到的反转录产物为模板,对过氧化物酶基因进行扩增。充分混匀后瞬离,于PCR仪上94℃预变性 5min,94℃变性 30s,58℃退火30s, 72℃延伸30s,35个循环,72℃延伸10min,16℃保存1h。取5μL PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
1.    3  原核表达载体的构建
提取质粒,测量浓度,计算,分别用BamHⅠ和Not Ⅰ双酶切1A片段和原核表达载体pSmart-I(+),回收1A基因和pSmart-I(+)载体片段,再次测量浓度,按照公式,计算出目的基因和载体片段的比例,用Ligation Mix连接过夜,第二天将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)。
细菌转化的步骤:将前一天的连接产物加入到200μL大肠杆菌 BL21感受态细菌中,切记用移液枪吹吸均匀,如果所用的BL21感受态细菌浓度过高,可以用0.1mol/L的CaCl2溶液稀释后使用。吹吸均匀后将其用封口膜封好,在冰上放置30min。30min后将 EP管移至 42℃水浴,90s 后快速转移至冰浴中,冰浴90s~2min。冰浴取出后,在超净台中加入0.8~1mL不含有抗生素的LB液体培养基,用封口膜包好,放置到37℃恒温摇床(150r/min)培养45~60min。然后放入离心机,以4℃ 5000r/min离心 5min,将离心所得的上清,在超净台中用移液枪弃去800μL ,将剩余的大约200 μL菌液重悬,用移液枪全部打到含有氨苄青霉素的固体培养基上,用酒精灯烧过冷却的玻璃棒均匀涂布菌液至涂干,平板倒置,在37℃恒温培养箱中培养过夜,约12-16h后来观察菌落生长情况,不能时间太久,会使菌落长得过大过密,不方便进行下一步挑菌实验。
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