BiFC融合载体的构建及鉴定,通过分析 Sw-5b 和 Nsm 基因序列上的克隆位点,添加 BamH I和 XhoI酶切位点,以连入目的基因的p2300-Sw-5b为模板进行PCR扩增。PCR产物和pSPYCE和pSPYNE载体 BamH I和 XhoI双酶切后直接回收,4℃放置冰箱连接过夜,转化,筛选后,凝胶电泳检测,割胶回收,回收产物送上海生工公司测序。测序结果正确,将构建成功的载体分别命名为psp-cYFE-Sw-5b和psp-NSm-nYFE。
构建pET28-NSm与pGEX-NTD1原核表达载体。使用BamH I和EcoR I将pGEX-4T质粒载体进行双酶切,用BamH I和Xho I进行将pET28载体质粒双酶切,酶切产物直接回收。以p2300-Sw-5b为模板PCR扩增扩增NTD1基因。琼脂糖电泳后,切胶纯化回收NTD1基因片段,与已经回收后的pGEX-4T质粒片段4℃冰箱连接过夜。转化 DH5ɑ,菌落PCR筛选,阳性克隆测序,查看测序结果。通过PCR扩增,以pHMTC-NSm为模板PCR扩增NSm,双酶切,直接回收,与pET28质粒酶切产物片段连接,4℃过夜。转化筛选后获得重组质粒pET28-NSm。
1.2.3 重组质粒转化根癌农杆菌GV3101 
制备根癌农杆菌GV3101感受态细胞,用电激的方法将重组质粒转化到GV3101细胞中,28℃,3 h,吸取100μL涂布于含Kan 100μg/mL的LB固体培养基上,放置28℃恒温培养箱中,48 h后,选取平板上单菌落,放置在加有抗生素的5mL 液体LB培养基中,摇菌过夜。
1.2.4 根癌农杆菌注射烟草及瞬时表达 
将菌液悬浮农杆菌处理液中,加入农杆菌处理液,调整OD约为0.2,28℃恒温培养箱中避光放置3个小时后,相互作用的的两种蛋白菌液等体积混合放入2ml EP管中,使用1ml 注射器注射入本氏烟草,每株注射处于顶部叶子下方的3片叶子,每种混合液注射半片叶子。存在无重组质粒的农杆菌菌液注射烟草作为阴性对照。
1.2.5 蛋白提取及免疫共沉淀 
将GV3101介导瞬时表达24-72 h后的烟草叶片剪取约0.2g ,在研钵中添加液氮,充分研磨,反复三次后,使之成为成粉末。用2.0-3.0 mL IP buffer悬浮,4℃、20000rpm离心10-15 min,保留上清,除去磨碎的细胞残骸。
1.2.6 SDS-PAGE与Western blot检测 
将蛋白样品放在95℃中加热5min ,加入终浓度为1×的loading buffer ,于10%的聚丙烯酞胺凝胶进行电泳,电压为80V 1h、120V 1.5h,使用托马斯亮蓝进行染色30min,加入洗脱液吸取染色,再光下观察分析。使用半干的方法将蛋白的条带转移到PVDF膜上,加入的一抗为anti-Flag或NSm抗体,二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG,开始Western blot鉴定。
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