绿盲蝽毒死蜱抗性品系中P450基因相对表达量的变化(2)
绿盲蝽（Apolygus lucorum）属于半翅目(Heteroptera)盲蝽科(Miridae)，其寄主含棉花等50余科200多种植物，主要为害我国黄河流域的大部分棉田，是一类重要的农业害虫(萧采瑜和孟祥玲，1963；Lu等，2008)。近些年来，我国在防治盲蝽的过程中由于杀虫剂的过度及不合理使用已导致其对杀虫剂的敏感性降低，引致抗药性问题。山东省聊城、滨州绿盲蝽种群对灭多威、硫丹和氟虫腈的敏感性下降（Guo et al.，2010；张小兵等，2013），河南新乡、安徽无为、山东滨州绿盲蝽种群对马拉硫磷、三氟氯氰菊酯和硫丹产生低水平抗性（谭瑶等，2012），2011至2014年间，黄河流域棉区的滨州及沧州种群对毒死蜱已产生中等水平抗性（11-20倍），抗性水平明显高于长江流域棉区的绿盲蝽种群（刘佳等，2015）。
本课题组筛选的绿盲蝽抗性品系对毒死蜱的抗性达到200倍，且为多基因控制的偏显性遗传，表明其抗性除靶标突变外（Wu et al.,2015)可能有代谢因子的参与，细胞色素P450极有可能在绿盲蝽对毒死蜱的代谢和抗性形成过程中发挥巨大作用。本文通过转录组测序技术分析绿盲蝽毒死蜱抗性品系中细胞色素P450超基因家族的表达信息，同时以实时定量PCR方法验证P450基因的表达量，研究结果将明确多功能氧化酶基因表达水平与绿盲蝽毒死蜱代谢抗性的关系，并为绿盲蝽的化学防治、抗性治理提供理论参考。
1 材料与方法
1．1 供试昆虫
绿盲蝽室内敏感品系(SLF)：2008年由中国农业科学院植物保护研究所河北廊坊基地提供，在室内人工饲养45代以上，期间未接触任何杀虫剂。
绿盲蝽敏感品系(BZS)：2009年7月采自山东省滨州市无棣县，在室内人工饲养30代以上，期间未接触任何杀虫剂。
绿盲蝽毒死蜱抗性品系(BZR)：由BZS品系在室内用毒死蜱筛选40代获得，每代保持50％的选择压力，至2017年3月对毒死蜱的抗性倍数达200倍。
饲养条件：温度为26±10℃，相对湿度为70％左右，光周期为15L：9D。成虫期饲喂四季豆。供产卵用的四季豆需要人为制造一些伤口，卵直接产于四季豆伤口处，之后收集孵化，若虫期饲喂新鲜玉米（陆宴辉等，2008）。
1．2 主要试剂和仪器
1．2．1 主要试剂
Tkara公司产品：PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，Dntp Mixture，rTaq，LA Taq，Ribonuclease Inhibitor；Invitrogen公司产品：TRIzol®，Random Primer；KAPA公司产品：SYBR® FAST qPCR Kit Master Mix。
1．2．2 主要仪器设备
Eppendorf5415R型冷冻离心机，德国eppendorf公司；凝胶成像系统Gel Doc2000，美国Bio-Rad公司；Nanodrop100光光度计，美国Thermo公司；实时荧光定量PCR仪ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System，美国应用生物系统公司。
1．3 试验方法
1．3．1 转录组测序
将绿盲蝽BZ-R、BZ-S品系各取大小相近、性比相等、羽化3~5天的成虫3管，每管50头，送至华大基因公司提取RNA并用新一代高通量测序技术进行转录组测序。
1．3．2 转录组数据分析
使用内部软件对测序数据进行过滤，得到clean reads；使用Trinity软件对clean reads进行de novo组装，然后使用Tgicl软件将组装的转录本进行聚类去冗余，得到Unigene；用Blast软件对Unigene进行NT(Nucleotide)、NR(Non-Redundant)、COG(Clusters of Orthologous Groups)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)以及Swissprot注释，用Blast2GO软件以及NR注释结果进行GO(gene ontology)注释，用InterProScan5软件进行Interpro注释；根据Tarazona等（2011）描述的NOIseq方法进行差异基因检测；通过注释信息和关键词搜索得到差异表达基因中的P450基因，从中选出6个可能与毒死蜱抗性相关的P450差异表达基因（以上所有涉及到的软件和数据库详细信息见附件）。