铜胁迫引起海州香薷和野草香氧化损伤的差异比较(3)
1 材料与方法
1．1 实验材料
海州香薷(种子采自安徽铜陵)；野草香(种子采自湖南吉首)。
1．2 实验设计与处理
挑选大小相似的种子均匀撒播于盛有已灭菌蛭石的周转箱中，在恒温温室中萌发；待幼苗的子叶展平，第一对真叶露出时，移至装有Hoagland营养液的器皿中培养。所用Hoagland营养液的组成见表1，营养液pH调至5.4~5.7。
表1 Hoagland营养液母液组成情况
大量元素 Fe-EDTA 微量元素
KNO3 101.10g/L FeSO4•7H2O 1.11g/L MnCl2•4H2O 1.81g/L
Ca(NO3)2•4H2O 236.15g/L Na2EDTA 1.49g/L H3BO3 2.86g/L
KH2PO4 136.09g/L ZnSO4•7H2O 0.22g/L
MgSO4•7H2O 246.47g/L CuSO4•5H2O 0.08g/L
H2MoO4•H2O 0.02g/L
设计3个Cu处理浓度，分别为CK(0.32µM)、25µM、50µM，每个处理有3个重复。处理7天后分别收获根系和地上部的样品。
1．3 测定方法
1．3．1 H2O2 积累的组织化学检测
采用DAB染色法：将2cm主根根尖和相似叶位的叶片浸入1% DAB 染色液（DAB 溶于10 mM MES-Tris缓冲液，pH 6.5）中，室温暗染8h。染色完成后，根尖用去离子水洗净，迅速置于配有数码相机的体视显微镜下观察、拍照。叶片用去离子水适当漂洗，再用95%乙醇脱色，脱色完成后于体视显微镜下观察、拍照[16]。
1．3．2 O2•-积累的组织化学检测
采用NBT染色法：将2cm主根根尖和相似叶位的叶片浸入0.1% NBT染色液(NBT 溶于含有10 mM NaN3的50mM的磷酸钾缓冲液，pH 6.5），室温光染30min。染色完成后，根尖用去离子水洗净，迅速置于配有数码相机的体视显微镜下观察、拍照。叶片用去离子水适当漂洗，再用95%乙醇脱色，脱色完成后于体视显微镜下观察、拍照[17]。
1．3．3 膜脂过氧化的组织化学检测
Schiff碱染色法：将2cm 主根根尖和相似叶位的叶片浸入Schiff试剂(200mL中含有：0.5g 碱性品红，0.5g K2S2O5, 100 mL 1N HCl, 100mL H2O)中染色 60min，然后用 0.5%的K2S2O5溶液 (溶于0.05M HCI )冲洗，置于配有数码相机的体视显微镜下观察、拍照。叶片用0.5%的K2S2O5溶液 (溶于0.05M HCI )适当漂洗，再用95%乙醇脱色，脱色完成后于体视显微镜下观察、拍照[18]。
1．3．4 H2O2 含量的测定
采用碘量法：分别取0.5 g新鲜植物根系和地上茎叶，液氮研磨，加入5 mL 0.1% TCA，10,000 ×g 、4℃下离心15 min。取0.5 mL上清液,加入0.5 mL 10 mM PBS (pH 7.0)和1 mL 1M KI溶液 ,充分摇匀，室温暗反应1h后，于390 nm下测吸光值。根据H2O2标准曲线计算H2O2 含量[19]。
1．3．5 O2•-产生速率的测定
分别取1g新鲜植物根系和地上茎叶，液氮研磨，加入65 mM PBS（pH 7.8），10,000 ×g 、4℃下离心10 min。取1 mL上清液，加入0.9 ml PBS（pH 7.8）和0.1 mL10mM盐酸羟胺溶液，混匀，25°C下反应20 min。取0.5 mL反应液，依次加入0.5 mL 17 mM 对氨基苯磺酸和0.5 mL 7 mM α-萘胺，25°C下反应20min。向反应液中加入同体积的三氯甲烷，充分摇匀，3, 000× g 、4℃下离心5 min，取水相测530 nm下吸光值，用PBS（pH 7.8）加盐酸羟胺溶液作空白[20]。
1．3．6 TBARS含量的测定
分别取 0.5 g 新鲜植物根系和地上茎叶，液氮研磨，加入5mL 0.1 % TCA，10,000 ×g 、4℃下离心15 min。取0.5 mL上清液，加入1.5 ml 配制的0.5% TBA (溶于20 %的 TCA溶液)，混匀后，95°C下反应30 min，取出后立刻冰浴冷却, 10,000 ×g 、4℃下离心15 min，取上清液测450nm、 532 nm 、600nm处吸光值[19]。
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