不结球白菜雄性不育系细胞质类型的鉴定(3)
1 材料与方法
1．1 植物材料与生化试剂
本研究所取植物材料：4种不结球白菜雄性不育系材料2016-LBC-025、2016-LBC-028-4、2016-LBC-E017-4、2016-LBC-E022-13和共有保持系‘苏州青’均取材于由南京农业大学园艺学院白菜课题组的江浦农场试验区。
生化试剂：Mix酶、PMD-19-T Vector、Solution I、Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞以及DNA提取和回收试剂盒购于Takara公司。PCR过程中所需特异引物来自金斯瑞生物科技有限公司。
1．2 花器官的形态学观察比较
随机选取不结球白菜4种雄性不育系材料2016-LBC-025、2016-LBC-028-4、2016-LBC-E017-4、2016-LBC-E022-13盛花期的花朵，观察其花器官形态特征，尤其关注其雄蕊的发育状况。
1.3 植物材料DNA制备
采用植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的制备，提取2016-LBC-025、2016-LBC-028-4、2016-LBC-E017-4、2016-LBC-E022-13及共有保持系‘苏州青’共5个样品的DNA。
取适量的植物新鲜组织，一般取约0.2~0.3 g，加入液氮进行充分研磨；将研磨好的粉末迅速加入到已混入0.1%巯基乙醇的700μL 65 ℃预热缓冲液GP1中，迅速颠倒混匀后65 ℃水浴20 min，此过程可多次颠倒离心管使样品充分混匀；加入700 μL 氯仿，充分混合均匀后12000 rmp 离心5 min；吸取上层水相加入到一个新的干净离心管中，加700 μL缓冲液GP2，振荡混匀；再将液体转入已放入收集管中的吸附柱CB3中，离心30 s，弃掉废液（若溶液体积过大，离心过程可分次进行）；加入500 μL GD到吸附柱中再次离心30 s，倒掉废液后向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（提前加入无水乙醇），12000 rmp离心30 s，倒掉废液；漂洗过程重复一次；将吸附柱CB3放回收集管，空转离心2 min，以尽量除去无水乙醇；吸附柱CB3室温中放置5-10 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；再转入新的干净离心管，将50-200 μL洗脱缓冲液TE悬空滴加到吸附膜中间部位，室温放置2-5 min后离心2 min，收集离心管中溶液。提取的DNA样品检测纯度后保存在-20℃条件下。
1.4 特异引物设计
根据已有文献中发布的Ogura CMS、Polima CMS不育相关基因分别是orf138、orf224[1][12]，确定两组引物序列如下，orf138P1：5’-TGGTCAACTCATCAGGCTC-3’；orf138P2：5’-GCCTCTAGGAGTAGTGAAGAAC-3’。orf224P3：5’-GCCTCAACTG-
-GATAAATTC-3’；orf224 P4：5’-CAAGGATCTCGTTCACCT-3’。