长期饲喂纳米氧化锌对小鼠锌代谢和微量元素（Fe,Cu,Mn,Zn）分布影响(3)
将小鼠饲养在聚丙烯笼中，并保持在20±5℃和12小时光照/暗循环的动物房屋中。给小鼠饲喂去离子水。食物和水的供应，房屋温度，行为模式和临床症状（嗜睡，昏迷，震颤，恶心，呕吐，腹泻等）将每天检查两次（8:00和18:00）。一旦出现临床症状，小鼠将被单独饲养。该实验的持续时间为32周，每周称重每只小鼠的体重，该实验没有小鼠死亡。
1.3 试验材料
1.3.1主要试剂
纳米氧化锌、甲醇、4%多聚甲醛溶液、PBS缓冲液、GOT试剂盒，GPT试剂盒、ALP试剂盒、引物、Trizol试剂盒、TAKARA反转录试剂盒、M-MLV-RT缓冲液、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（TakaRa Bio-technology Co.Ltd，大连）。
1.3.2主要仪器
电子台秤（广东新和基科技开发有限公司）、匀浆机、水浴锅（常州华普达教学仪器有限公司）、高速冷冻离心机、1.5ml小型离心机、0.2 ml小型离心机、振荡器、Malvern Autosier（Malvern Instruments，Malvern，UK）、200ul离心管架、进口移液枪、眼科剪、小镊子、弯头镊子、自制冰盒、Nanodrop ND-1000紫外微量分光光度计、2.5ul移液枪及枪头、1.5ml小型离心机、透射电子显微镜（TEM，JEM-200CX，Japan）、普通PCR仪、200ul离心管架。
1.4 样品采集
在饲养试验结束时，称重小鼠（12小时快速），并通过二氧化碳窒息法处死。 血液样品在4℃下以3000×g离心15分钟，得到血清，保存在-20℃直到分析。 称重肝脏，肾脏，脑，脾脏，心脏，胰腺和睾丸，并计算相对器官重量（器官重量：体重）。选择的组织和大腿肌（股直肌和股内侧肌）和骨（胫骨和腓骨）样品在-20℃下储存。收集距离幽门括约肌7cm距离的4cm空肠样品，置于液氮中快速冷冻，并储存在-80℃直至分析锌代谢。
1.5测定指标及方法
1.5.1生长性能
实验开始时，固定每周日记录小鼠初始体重直至第35周实验结束，并计算平均日增重。
1.5.2血清生化指标分析
通过购自南京建成生物工程研究所（中国南京）的相应商业试剂盒测定血清中锌的浓度和谷草转氨酶（GOT），谷丙转氨酶（GPT）和碱性磷酸酶（ALP）的活性。这些血清参数用每个试剂盒的推荐程序测定。
1.5.3微量元素的测定
测定组织的矿物质浓度（Zn，Fe，Cu和Mn），包括肝脏，肾脏，脑，胰腺，睾丸，大腿肌（股直肌和股内侧肌）和骨（胫骨和腓骨），使用酸性混合物（HNO 3 :HClO 4 = 4:1，v:v）消化组织（0.5-1.5g）。 消化物用软化水调至25ml。制备空白和标准溶液。之后，通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，USA）测定矿物质浓度。
1.5.4空肠锌代谢相关mRNA表达的测定
根据制造商的介绍（Invitrogen，USA），用Trizol试剂提取空肠总RNA。之后，通过纳米滴2000（包括260/280nm和260 / 230nm在1.90和2.05之间的吸收比）验证RNA质量，并通过琼脂糖凝胶电泳，将2μgRNA置于72℃下的随机引物（ Promega，比较）中5分钟，用逆转录混合物（Takara，大连，中国）孵育1小时，包括5×M-MLV-RT缓冲液，M-MLV逆转录酶和dNTP。最后，逆转录在90℃灭活10分钟。
在本研究中，金属硫蛋白1（MT1），金属硫蛋白2（MT2），溶质载体家族39成员8（ZIP8），溶质载体家族39成员8（ZIP14），溶质载体家族30成员1（ZnT1），溶质载体家族30成员2（ZnT2）和溶质载体家族30成员4（ZnT4）的Zn代谢相关基因表达在空肠中的测定。基因特异性引物列于表1中，并由Invitrogen Biotech Co. LTD（上海，中国）合成。选择β-肌动蛋白作为管家基因。根据制造商的说明使用ABBR 7300 RT-PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA），SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（TakaRa Bio-technology Co.Ltd，大连）进行逆转录多聚酶链反应（RT-PCR，中国）。用ABI软件测定相对mRNA表达，并用Livak，Schmittgen [11]所述的2- Ct计算。