基于点击化学的电化学DNA生物传感分析(2)
DNA自身的组成单元很适合进行电化学分析检测，例如DNA链对电子的传递作用等，很多电化学检测方法都是基于DNA分子的此类特性[2]。电化学检测DNA，根据检测方法的不同，通常可以分为直接检测和间接检测这两类。直接检测的依据在于DNA分子可以直接与电极表面快速地进行电子传递，而且DNA分子中的脱氧核糖和碱基具有一定的电化学活性[2]。直接电化学方法主要是通过测定DNA中鸟嘌呤G、腺嘌呤A和脱氧核糖在一定电位范围内的氧化电流来实现对特异性目标DNA片段的定量测定[2]。DNA中的鸟嘌呤G由于较其他碱基具有更强的氧化还原特性，常被用于构建无标记型DNA电化学生物传感器，用于基因分析[4,5]和突变检测[6]等领域。例如，Erdem等[7]将修饰有氨基末端的DNA固定在氧化石墨烯功能化的石墨电极表面作为捕获探针，与特异性目标DNA片段杂交后，通过检测鸟嘌呤的电化学氧化信号，实现了对特异性目标DNA片段的直接电化学检测。在DNA的电化学检测过程中，间接检测方法是在DNA链上结合或嵌插一些氧化还原指示剂（如邻菲咯啉合钴、溴化乙锭、亚甲基蓝等），或者在DNA链上标记各种电活性标记物，通过检测氧化还原指示剂或电活性标记物的电化学信号，实现对DNA的间接检测[2]。标记电活性物质实现DNA的电化学检测的方法通常是在目标DNA片段（或信号探针）的一端标记电活性物质，如亚甲基蓝、二茂铁或者纳米粒子等，通过检测电活性物质在电极表面所产生的电化学信号，实现DNA的间接检测[2]。例如，Han等以聚乙烯亚胺和[Co(phen)3]3+为原料，合成了一种阳离子电活性复合物，该复合物既可以与DNA的电负性脱氧核糖磷酸骨架通过静电相互作用结合，又可以作为嵌入剂插入到杂交反应形成的双螺旋复合物中，可用作DNA电化学检测过程中的电活性标记物[8]。Wong等将捕获探针DNA通过共价键和作用固定在玻碳电极表面，与特异性目标DNA片段杂交后，通过Zr4+的配位键合作用，将二茂铁甲酸连接到电极表面，作为DNA检测时的电化学标记[9]。
1.2 单核苷酸多态性分析
与疾病相关的特定DNA序列的检测、DNA碱基突变，尤其是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的检测对于疾病的早期诊断和预后监测、基因分型等具有十分重要的意义[10]。SNPs是指基因序列上单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入与缺失。其中转换是指同类型碱基间的取代，颠换是指不同类型间的取代[11]。SNPs在人群中的发生频率大于1%，且具有数量多、分布广和遗传稳定等特点[12]，已被认为是继限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和微卫星多态性(microstatellite polymorphism，SSR)两种遗传标记之后的新一代遗传学标记[13]。截至2012年6月26日，单核苷酸多态性数据库（dbSNP）已列出人类的53,558,214个SNPs位点[14]。SNPs位点已被用于全基因组关联研究（GWAS），例如，基因图谱中的高分辨率标记与疾病或正常的特征有关。SNPs的知识将有助于了解药物的代谢动力学（PK）或药效动力学，即在不同的遗传变异个体中药物是如何发挥作用的。SNPs可能会导致广泛的人类疾病，如癌症、传染性疾病（艾滋病，麻风病，肝炎等）、自身免疫性疾病、神经精神性疾病、镰状细胞贫血、β-地中海贫血症及囊性纤文化等[15-19]。与不同SNPs相关的疾病将可能成为药物治疗的主要基因组目标[20]。某些SNPs与不同药物的代谢有关[21-23]。因其世代中的数量及稳定遗传，对表型没有影响的SNPs在全基因组关联研究（GWAS）中也仍然有用[24]。例如，rs6311和rs6313是人类13号染色体上HTR2A基因的SNPs；F5基因的SNPs导致血液高凝状态失调的基因突变；rs3091244是人类1号染色体的CRP基因上的三等位基因的SNPs[25]；TAS2R38为品尝能力的遗传密码，包含6个标注的SNPs位点[26]；FCN1基因rs148649884和rs138055828编码可削弱重组M-ficolin配体的结合能力[27]。因此，SNPs分析在实现遗传疾病的早期医学诊断以及发病机理研究等方面具有非常重要的意义，已成为当今分析化学和生命科学研究领域的热点。目前，用于发现新的SNPs及检测已知SNPs的常用分析方法包括：DNA测序[28]、毛细管电泳[29]、质谱法[30]、单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、电化学分析、变性HPLC与凝胶电泳、限制性片段长度多态性与杂交分析等。其中，电化学分析方法由于具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、便携、设备简单、可在复杂的体系中进行连续在线监测，且易于小型化、集成化、自动化及能与微流控芯片兼容等优点，因而在SNPs分析中具有独特的优越性。