蜡质芽孢杆菌AR156激发类似flg22介导植物免疫反应(2)
近年来的研究表明，根围促生细菌蜡质芽孢杆菌AR156诱导植物产生的抗病免疫反应和flg22诱导的植物的病原物相关分子模式触发的免疫反应(PAMP-triggered immunity, PTI）有很多相似的地方[2]。目前对于flg22诱导植物产生抗病性极其分子机制研究已经较为深入，因此我们将就AR156是否能诱导植物产生和flg22相似的PTI反应进行实验，并对AR156诱导植物产生抗病性的分子机制，即AR156诱导植物产生抗病性是否依赖于茉莉酸（jasmonic acid, JA）、乙烯(ethylene, ET)以及水杨酸（salicylic acid, SA）通路进行进一步的探究。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 供试植物培养
供试拟南芥（Arabidopsis thaliana）的品种为“Col-0 WT、以及jar1、etr1、ein2、sid2-2、nprl、NahG”。首先将拟南芥种子均匀播种于育苗盘中，置于4 ℃春化处理3-5 d后，转移到22 ℃，光周期为光照10 h，黑暗14 h，相对湿度为40％-60%的温室中进行培育。待拟南芥苗长到2-3片真叶时（7d左右）进行移栽，移栽前在盆内放三分之一盆营养土后，加入蛭石覆盖满盆后以营养水浸透，移栽时每盆移栽3棵拟南芥幼苗，之后于同样条件的温室中继续培育四周。
1.1.2 供试菌剂培养
所用生防菌为蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）AR156。该菌株于-70 ℃冰箱保存，使用前在LB培养基上划线，28℃培养24 h。挑选长出的单一菌株转接到2 ml LB培养液中，28℃，200 r•min-1培养24 h成初培菌液，然后以1：1000比率接种到20 ml LB培养液中，28 ℃，200 r•min-1扩繁24 h，所得菌液于室温6000 rpm离心10 min收集菌体，再用灭过菌的超纯水重悬调整浓度至5.0×107 cfu•ml-1备用。
1.1.3抗生素和K.B培养基配制
a.抗生素利福平的配制：将利福平溶解在水中，配制成50 mg•ml-1的利福平母液，配制好的母液在超净台上用细菌过滤器过滤，分装后置于-20 ℃冷藏箱中备用。使用时按1:1000的比例稀释成50 mg•l-1即可。
b.抗生素卡那霉素的配制：将卡那霉素溶解在DMSO中，配制成50 mg•ml-1的卡那霉素母液，配制好的母液在超净台上用细菌过滤器过滤，分装后置于-20 ℃冷藏箱中备用。使用时按1:1000的比例稀释成50 mg•l-1即可。
c.K.B培养基（1 L）的配制：蛋白胨：20 g，甘油：10 mL，K2HP04: 1.5 g，MgSO4: 5 ml（1 M•L-1，无菌），用KOH调节PH至7.0，琼脂粉：15 g。注：MgSO4需于培养基灭菌后加，灭菌前加会导致培养基变浑浊。
1.1.4 供试病原菌的处理
供试病原菌为丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000，在28 ℃条件下置于含有50 mg•L-1利福平和卡那霉素的K.B板上生长过夜，之后通过离心沉淀细菌细胞，并将其重悬于10 mM Mgcl2中，定容至5.0×105 cfu•ml-1备用[3]。
1.2 方法
1.2.1 AR156和flg22一样能诱导植物产生抗病性验证
选取生长了4周的拟南芥(品种为Col-0 WT)，取每株拟南芥上3片叶龄、长势一致的叶片做好标记。分3组处理，即用5.0×107 cfu•ml-1 AR156，1μM flg22, 无菌水（对照）分别注射拟南芥叶片。24 h后在处理过的拟南芥叶片上注射浓度为5.0×105 cfu•ml-1的丁香假单孢菌番茄致病变种Pst DC3000；接种后用保鲜膜覆盖保湿12 h，揭去保鲜膜，置于22 ℃，光周期为光照10 h,黑暗14 h，相对湿度为40％-60%的温室继续培养，当植株叶片出现差异性发病表型时，对发病叶片进行取样拍照，并观察比较植株叶片发病表型差异。
接种病原菌Pst DC3000培养48 h后，对植株叶片取样进行致病性测定。取样前用75%的无水乙醇反复擦洗预取样的叶片两到三次进行消毒处理，然后取直径相同的打孔器截取叶片，每个截取的叶片样品分别放入一个EP管中，加10 mM Mgcl2研磨，之后吸取50 μL振荡液进行梯度稀释(吸取前将振荡液摇匀)，梯度稀释后将其涂布在K.B培养基中（为确保实验准确度每个处理设置10个平行处理）。在28 ℃培养箱中培养48 h。48 h后统计K.B板上的菌落数，统计分析数据。