构建circRNA4235和circRNA4595转基因植物(2)
引言
环状 RNA[1](是一种特殊的内源性非编码 RNA( noncoding RNA ncRNA) ，是继微小RNA ( microRNA，miＲNA)及 长 链 非 编 码RNA( long noncoding RNA，lncRNA) 后的RNA家族又一研究新热点。Sanger[2] 等在 20 世纪 70 年代发现某些高等植物中存在可致病的单链环状类病毒，这是人类首次发现 circRNA。随后人们陆续在酵母线粒体、丁型肝炎病毒中发现 circRNA，也发现在小鼠的睾丸内含有性别决定基因( sex-determining region Y，Sry)转录而来的 circRNA，还证实了circRNA 也存在于人体细胞。虽然发现的很早，但在过去的几十年里，circRNA的研究却始终进展缓慢。
随着高通量测序及生物信息学的快速发展，越来越多的 circRNA 在生物体中被发现，它们并非偶然存在，也并非对基因表达毫无作用。它们广泛的，多样化的，保守的，稳定的存在于真核生物中，丰富了RNA家族的内容。利用 RNA 测序( RNAsequen-cing，RNA-seq) 原理，发现 circRNA广泛存在于古生菌中，并且可能具有未知的生物学功能，circRNA在人类细胞的基因表达程序中是普遍存在的，并以一种非经典的剪接形式产生。
证明了 circRNA普遍存在后，研究人员又把目光投向 circRNA的产生机制和功能上。Salaman[2]等的研究表明，数以百计的人类基因可以转录形成circRNA；Jeck等人在人类成纤文细胞中检测到了25000多种的circRNA；Menczak等通过结合RNA-seq数据和人类白细胞数据库，鉴定出1950种人类circRNA、1903种小鼠circRNA（其中81种与人类circRNA相同）和724种线虫circRNA；近几年，研究者在植物中也发现circRNA的存在。
本实验通过在拟南芥中有效的农杆菌介导转化途径[3] ，构建circRNA4235和circRNA4595的突变体和过表达植株，运用PCR技术、酶切技术、转化、胶回收等实验方法，来研究circRNA在拟南芥中的生理作用。
1.材料
1.1植物材料
本实验的模式植物为拟南芥（Arabidopsis thaliana），哥伦比亚野生型（Col.Columbia）,由实验室王琳师姐提供，具有其它植物无法取代的优点：生长周期短，基因组小，染色体少，具有双子叶植物的所有特性。
1.2实验仪器
(1)PCR 仪：杭州博日科技有限公司；
(2)恒温摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；
(3)超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；
(4)37℃培养箱 ：上海一恒科学仪器有限公司；
(5)28℃培养箱 ：上海跃进医疗器械有限公司；
(6)电热恒温水浴锅 ：上海精宏实验设备有限公司；
(7) 漩涡震荡仪 (8)高压灭菌锅 (9)微波炉 (10)电子天平
(11)凝胶成相仪器 (12)超速离心机 (13)电泳仪等
1.3载体与菌株
中间载体pENTR,最终载体pEG202、大肠杆菌菌株JM109、农杆菌菌株GV3101等均为本实验室王琳师姐提供。
1.4主要试剂
T4 DNA连接酶、 Taq 酶、DNA限制性内切酶、LR酶、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、Clean-up 试剂盒、质粒提取试剂盒均有实验室提供。
1.5实验所用培养基
1.5.1 LB培养基（1L）如表1
表1 LB培养基（1L）体系
LB培养基1 L
多聚蛋白胨 10 g
酵母提取物 5 g
氯化钠 10 g
琼脂粉 20 g
加蒸馏水溶解后定容至1 L
固体LB培养基需要加1-2％琼脂粉。定量称取上述物质于烧杯中，加超纯水至1000 ml, 120℃高压灭菌20 min。
1.5.2培养基所用抗生素
本研究所涉及大肠杆菌菌株JM109培养基所用的抗生素为卡那霉素（kanamycin）。涉及农杆菌菌株GV3101培养基所用的抗生素为RGK。R:利福平，G:庆大霉素（王琳师姐提供），K:卡那霉素。