一氧化氮参与水稻低磷低氮调控的根系生长的机制研究(2)
本实验主要通过分析不同氮、磷处理条件下水稻根尖一氧化氮水平、施加一氧化氮供体和清除剂后观察水稻种子根长度变化，以及使用Osnia2突变体来研究一氧化氮在不同氮、磷营养调控水稻种子根伸长过程中的作用。
1材料和方法
1.1植物材料
本实验采的野生型水稻为shiokari（由日本东北大学生命科学研究科提供）与Dongjin（购自韩国浦项市）。突变体为T-DNA插入突变体Osnia2两个株系（nia2-1和nia2-2），属于Dongjin背景。
1.2生长条件
发苗处理
种子经30 % H2O2消毒30 min，在清水中育苗7天。
转移处理
选择地上部及根系大小形态均一致的幼苗，去种子后一次在1/4、1/3和1/2的营养液中培养7天，然后移栽至pH 5.5的国际水稻所（IRRI）修正营养液培养14天。
国际水稻所（IRRI）修正营养液成分
（mM）0.35 K2SO4，1.0 CaCl2，1.0 MgSO4•7H2O，0.5 Na2SiO3和（µM）20.0 Fe-EDTA，9.0 MnCl2，0.39 (NH4)6Mo7O24，20.0 H3BO3，0.77 ZnSO4，0.32 CuSO4，其中低氮处理为0.01 mM NH4NO3；低磷处理为2µM KH2PO4；对照处理为1.25 mM NH4NO3和300 µM KH2PO4。
外源一氧化氮供体（SNP）、一氧化氮清除剂（cPTIO）、NOS清除剂（L-NAME）、NR清除剂（Tungstate）处理
水稻移栽后，分别在营养液中施加外源一氧化氮SNP（0-20 μM），一氧化氮清除剂cPTIO（80 μM），NOS清除剂L-NAME（100 μM），NR清除剂Tungstate（25 μM）。
1.3根系形态测量
在设置的试验条件下，种子根的长度显著长于不定根。预实验的结果显示，种子根和不定根对低氮、低磷的处理的反应是相似的。因此，选择种子根作为指标来进行低氮和低磷对水稻根系影响的研究，种子根长度主要是通过刻度尺进行测量。
1.4根尖NO的测量方式
使用一氧化氮特异性染料DAF-FMDA对水稻根尖染色，然后在荧光显微镜下观察。水稻根尖浸泡在20 mM HEPES-NaOH缓冲液（包含10 µMDAF-FMDA）（pH 7.5）中，处于黑暗条件下30分钟，根尖用新鲜的缓冲液清洗三次，使用立体显微镜进行观察，采用彩色CCD摄影机，激发光波长为488 nm，发射光波长为495-575 nm（OLYMPUS MVX10）。绿色荧光信号水平主要通过Photoshop软件进行量化。
1.5硝酸还原酶的测量方式
采用离体法测定根系的NR活性[8]。采集水稻根系，迅速置于液氮中，剪碎根系后加5 mL提取缓冲液（5 mmol L-1 EDTA和5 mmol L-1），半胱氨酸溶于0.025 mol L-l磷酸缓冲液（pH 8.7）中，电子供体为（2 mg mL-1 NADH）和少量石英砂于研钵中，冰浴研磨至匀浆后，将其转移至10 ml离心管中，4000 r min-1离心15 min，上清液即为酶粗提液。另取一离心管加入1 mL KNO3、0.6 mL NADH和0.4 mL酶粗提液，混匀后25 ℃反应30 min，立即加入0.5 mL a-磺胺中和过量的NADH，终止反应。反应结束后加入0.5 mL萘胺，2000 r min-1离心15 min，使用酶标仪测定其在540 nm处的吸光值。以0.1 mol L-1磷酸缓冲液（pH7.4）代替NADH为对照。根据回归方程计算出反应液中产生的NO2--N的总量。在提取液及分析液中均含有5 mmol L-1EDTA条件下测定NR活性。
1.6水稻总RNA提取与qRT-PCR反应
植物总RNA提取使用TRizol试剂（Invitrogen），并严格按照其操作指南进行。逆转录及cDNA合成参照附录一。qRT-PCR检测参照附录二。
1.7数据分析
数据采用SPSS软件进行ANVOA方差分析和多重比较，文中的数据表示为平均值±SE，不同字母代表处理间在5 %水平上的差异显著。
所有的统计评估进行SPSS（版本11）统计软件。
2结果与分析
2.1NO参与水稻根的伸长
低氮、低磷条件下野生型水稻（Shiokari）种子根长度以及根尖一氧化氮的积累如图2-1所示。图中，水稻苗分别在正常营养条件（正常氮，2.5 mM；正常磷，300 µM）和低氮、低磷处理（低氮，0.02 mM；低磷，2 µM）下水培14天。A，低氮、低磷条件下水稻植株表型；B，连续时间段水稻种子根长度；C，根尖一氧化氮的水平；D，一氧化氮水平的量化。