四氢叶酸依赖型的麦草畏脱甲基酶基因表达纯化和特性研究(2)
1. 4．1 麦草畏脱甲基酶活性的测定8
1. 4．2 酶促反应的产物检测与鉴定8
1. 5 环境对酶活力的影响8
1. 5．1 温度对酶活力的影响8
1. 5．2 pH对酶活力的影响8
1. 5．3 金属对酶活力的影响8
2结果与分析8
2. 1 PCR扩增dmt66基因8
2．2 dmt66基因表达载体的构建9
2. 3 脱甲基酶dmt66的纯化9
2．4 目的蛋白含量的测定10
2. 5 Dmt66的功能验证10
2. 6 温度对酶活力的影响12
2. 7 pH对酶活力的影响13
2. 8 金属离子对酶活力的影响13
3讨论 14
致谢14
参考文献15
四氢叶酸依赖型的麦草畏脱甲基酶基因表达、纯化和特性研究
引言
除草剂是指一类可以使田间杂草生长受到抑制，或选择性地使之死亡的药剂。麦草畏（Dicamba）是一种被人类广泛使用的除草剂，又称百草敌(Banvel)，它的分子为3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，其作用机理属于激素型除草剂，杂草中毒症状与生长素物质的作用症状相似[1]。麦草畏是一后生长素类除草剂，它的持效期长，目前主要用于谷物、玉米、等作物田间的杂草防除[2]。麦草畏药效较快，施药一天后杂草就会出现畸形卷曲症状，一般在一周至两周的时间跨度内可致死[3]。
施用麦草畏后，农作物是否对于麦草畏有耐受度也成为了科学家们关心一大问题。在洪慧龙等人[4]的报道中，我们可以得知随着麦草畏底物浓度的增加，不同植物品种对麦草畏的耐受性存在着显著的差异，植物品种对于麦草畏的耐受性逐渐降低，因此如何提高农作物对农药麦草畏的耐受性也成为了麦草畏在广泛被施用前待解决的一个项目。
由于目前麦草畏应用范围非常广泛，因此耐麦草畏转基因作物也应运而生，麦草畏也成为了前景广阔的转基因植物靶标除草剂[5-7]。微生物因其物种多样性和代谢途径多样性，其基因资源是除草剂降解基因的重要来源。微生物中麦草畏脱甲基酶在早期就已有报道，如Meßer (1996)在厌氧细菌Moorella thermoacetica中发现了四氢叶酸依赖型脱甲基酶Mtv等[8]本实验室分离筛选到一株麦草畏降解菌株Sphingomonas sp. Ndbn-20，研究了其降解麦草畏的代谢途径并找到了关键的降解基因。麦草畏首先在脱甲基酶的作用下生成中间代谢产物3, 6-二氯水杨酸（DCSA），然后再进行后续代谢。先前的研究发现，在菌株Ndbn-20有3个基因簇上具有四氢叶酸依赖型的脱甲基酶基因，分别是dmt02，dmt50与dmt66，其中dmt02无麦草畏脱甲基活性，dmt50的相关特性已有研究。本文将脱甲基酶的基因dmt66构建到原核表达质粒pET 29a(+)中，利用原核表达细胞Escherichia coli Origami 2 (DE3)进行大量体外表达麦草畏脱甲基酶，通过利用亲和纯化表达出的蛋白，再利用高效液相色谱技术分析底物麦草畏的降解率，并进一步研究了其在不同环境下的酶活力[9],[10]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 试剂与培养基
四氢叶酸(THF,65%)，购买自Sigma-Aldrich (上海,中国); 5-甲基-四氢叶酸(5-methyl-THF,98%)，购买自上海百灵威化学技术有限公司。
菌株E. coli Origami 2 (DE3)为本实验室分离并保存，培养时选用LB液体或固体培养基。
LB配方：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000 mL (固体LB培养基中添加1.5%的琼脂粉)。
抗生素的工作浓度：卡纳霉素（Km）50 mg•L-1。
诱导剂IPTG母液浓度为1mol•L-1。
TALON®纯化柱购自GE公司；其他试剂均为国产分析纯（降解产物分析试剂为色谱纯），购买自江苏汉邦科技有限公司。
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