进境苹果重要病原真菌高通量测序排查及检测技术研究(2)
2.3自建数据库比对结果分析 21
2.4比对正确率统计 31
第四节 讨论 31
致谢 31
参考文献 31
进境苹果重要病原真菌高通量测序排查及检测技术研究
引言
苹果上携带的重要病原真菌种类很多。2012以来全国共进口苹果货物达800多批次，截获检疫性有害生物7批次，非检疫性有害生物928种次。其中，从意大利苹果树苗中截获葡萄茎枯病菌（Phoma glomerata）、从美国和智利进口苹果中截获苹果牛眼果腐病（Neofabraea perennans）、从中国香港入境苹果中截获的苹果黑星病菌、从美国、智利、新西兰、法国和日本进口的鲜苹果中截获过苹果牛眼果腐病（Neofabraea malicorticis）、从美国截获苹果球壳孢腐烂病菌、从美国、智利和中国香港截获苹果果腐病菌等检疫性有害生物。同时，由旅客携带入境的苹果来源则更广泛，风险也很高，从旅检中也多次截获检疫性有害生物。
苹果能携带十余种检疫性有害生物及几十种危险性病原真菌，通过贸易及旅客携带传入我国的风险极高，开展苹果病原菌的检测技术研究对保护我国苹果等水果生产和贸易具有重要的检疫意义。
目前，国内已有或正在制定苹果检疫性病原真菌的检疫鉴定方法，大部分鉴定的依据是病原菌形态学和传统的分子生物学方法。因此，目前针对苹果病原菌检测技术方面主要有以下几个方面的不足:①基于形态学特征的传统分类与鉴定方法，主要依赖专家经验，鉴定周期长，对于特征不典型或难于产孢的病原真菌难以准确鉴定；②基于核酸的分子生物学检测技术，主要包括常规PCR、实时荧光PCR、生物芯片等技术，灵敏度和特异性相对较高，但存在检测通量低，一次只能检测某一种病原菌的不足；③还没有苹果牛眼果腐病（N. malicorticis）及其近似种（N. perennans、N. alba）、丁香疫霉及其近似种（冬生疫霉）等病原菌PCR检测方法，只能依靠形态学的鉴定方法；④集成化和自动化检测技术水平低。
苹果作为我国重要的贸易水果产品，其所携带的重要的病原菌种类多，检疫风险极高。本实验以构建苹果病原菌DNA信息数据库为基础，采用生物信息学技术手段，一次性检测多种病原菌，从分子水平上快速检测苹果上携带的多种目标菌，既可以满足货物快速通关的需要，又可以防止危险性病原菌通过贸易和旅客携带等方式传入我国，从而保护我国苹果等水果的生产和生态安全。
第一节227种苹果病原菌ITS信息数据库的构建
1 材料与方法
1．1 供试材料与菌株
参试菌株为2016年间南京、深圳、上海口岸截获的来自世界各国的227种苹果病原菌样品。
1．2 菌株DNA提取
将呈现病斑的表皮从苹果上分离，置于PDA固体培养基上，25℃恒温培养3-5天，至真菌生长达到对数期后，挑取菌落进行DNA的提取。
真菌DNA提取采用改进的CTAB方法。首先，挑去菌丝体，转移至2mL无菌离心管中。加入40μL 10% SDS和小钢珠2个，用球磨仪（德国Retsch，莱驰MM400）以30次/秒频率震荡处理5-10min；再加入600μL 1% CTAB裂解液 （0.05mol/L Tris-Hcl pH8.0，0.7mol/L NaCl，0.01mol/L EDTA pH8.0）震荡混匀；放入恒温震荡水浴中孵育0.5-2h （350r/min，65℃）。加入600μL 饱和的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀后高速离心12000r/min，5min。取400μL上清液，加入氯仿（上清液：氯仿=1：1）充分混匀后高速离心12000r/min，5min。取上清，加入300μL，-20℃预冷的异丙醇，充分混匀，离心12000r/min，10min。弃掉上清，加入600μL预冷的75%乙醇，离心12000r/min，5min。弃上清，自然干燥后加入50-100uL ddH2O，震荡混匀。然后用Nanodrop2000超微量分光光度计（Thermo）测量DNA浓度, 最后放-20℃保存。