1.实验部分
1.1 实验所用材料、仪器及试剂
材料:怀牛膝,购买于周口市同和堂药店。
试剂:氯仿、正丁醇、乙醚、苯酚、浓硫酸、双氧水、丙酮、乙醇、盐酸、甲醇等均为分析纯。
主要仪器:S22pc可见分光光度计(上海凌光技术有限公司);恒温水浴锅HH-S6(巩义市矛华仪器有限责任公司);海尔冰箱BCD-215KCM(青岛海尔股份有限公司);恒温振荡器LRH(上海一恒科学仪器有限公司);系列生化培养箱THZ -98AB(昆山一恒仪器有限公司);电子天平AL204(梅特勒托利多仪器上海有限公司);HC-3018高速离心机(安徽中科中佳科学有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海恒科技术有限公司);SYQ-DSX-280B不锈钢压力蒸汽灭菌器(上海恒科技术有限公司);SW-CJ-2FD型洁净操作台(苏州安泰空气技术有限公司);SHB-III循环水式真空泵(郑州欧卡仪器设备有限公司);微波炉(海尔集团有限公司)。
1.2 怀牛膝多糖的提取及含量测定
多糖含量的测定采用苯酚硫酸法[6-7],以葡萄糖为标准品,蒸馏水作为提取剂。苯酚硫酸法的原理是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物,再以比色法测定。
1.2.1 葡萄糖标准溶液的配制
准确的称取0.1g葡萄糖并用蒸馏水溶解定容至1000 mL,配制成100 μg/mL的标准溶液。
1.2.2 标准曲线的绘制
准确的分别移取标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 mL浓度为100 μg/mL的葡萄糖溶液,置于各个试管中,全部加蒸馏水补足至每试管1 mL,然后各加入1 mL 的6%的苯酚溶液,摇均匀,再依次加入5 mL 的98%浓硫酸,摇均匀,都要经过15 min的静止,置于温度为40℃的条件下30 min,取出冷却,于波长490 nm处测定吸光度D490 nm,结果如表1、图1。将待测试管中葡萄糖的浓度与吸光度作回归处理,得到回归方程y=0.0073x-0.0188。
表1 葡萄糖浓度与吸光度的关系
葡萄糖浓度
C(μg/mL)    0    10    20    30    40    50    60    70    80    90
吸光度A    0    0.036    0.147    0.165    0.286    0.341    0.404    0.491    0.566    0.641
 
图1 葡萄糖标准曲线
1.2.3 怀牛膝多糖提取的工艺流程[8]
微波辅助提取法:干燥的怀牛膝→剪碎称取40 g→加入1:20的蒸馏水→在80℃温度下水浴浸泡2 h→微波提取一次→抽滤→微波提取一次→抽滤→合并提取液→按照5:1的比例在合并液中加入氯仿、正丁醇混合液(氯仿:正丁醇=5:1)后充分摇匀(目的除去蛋白质)→离心(3000 r/min,10 min),取上清→烘箱浓缩→按照浓缩液与乙醇比为1:3的比例加入无水乙醇(使多糖沉淀)→搅拌均匀、静置过夜→离心(3000 r/min,15 min),取沉淀→用乙醚洗涤沉淀→牛膝多糖粗提物→加蒸馏水定融到50 mL容量瓶。
热水浸取法:怀牛膝与蒸馏水1:20,浸提在水的温度为80℃里,提前浸泡24 h(不需要微波),再抽滤,按上述步骤重复一次。其他热水浸提步骤与微波辅助提取完全一样。
1.2.4 怀牛膝多糖提取率的测定[9-11]
从不同提取方法的粗提取液中各取出1 mL,定容于1000 mL的容量瓶里。摇匀,再各取出1 mL置于10 mL的试管中,各加入6%的苯酚溶液1 mL,摇匀,依次加入98%的浓硫酸5 mL,摇匀,静止15 min后,置于40℃的条件下30 min,冷却,于波长490 nm处测定吸光度。根据回归方程算出测量多糖的C(μg/mL),按照以下公式计算提取物多糖的提取率(mg/g)。
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