水稻转录因子OsMADS57对水稻氮素积累的影响(2)
3.5OsMADS57沉默突变体和超表达植株相关基因的表达18
4讨论19
致谢 20
参考文献20
水稻转录因子OsMADS57对水稻氮素积累的影响
1.引言
尽管水稻是喜铵作物，但是水稻的根系实际是在NH4+、低浓度NO3-混合营养中[1]。有研究表明，增硝营养利于水稻的生长[2]。MADS是一类规模庞大而且高度保守的基因家族，在动物、植物和真菌中都有该家族基因的存在。在水稻中已经发现了近75个MADS-box转录因子[3]。
拟南芥中，AGL17-like亚家族基因主要是参与调控植物营养器官的发育。AGL21参与促进侧根的发育，尤其是在缺氮条件下agl21会严重抑制侧根的发育[4]。水稻中，AGL17-like亚家族基因OsMADS25依赖于NO3-促进根系的发育，同时促进植物体内的硝态氮积累。前期结果表明，水稻中AGL17-like亚家族中OsMADS57主要在营养器官中表达，而且受NO3-诱导表达，那OsMADS57是否参与NO3-调控水稻的生长呢？
为进一步研究OsMADS57基因功能，我们获得了3个T-DNA插入的突变体株系，构建CRISPR-Cas9介导的突变体，获得7个纯合体株系。同时通过转基因手段创建OsMADS57超表达株系，获得了2个稳定遗传的T2代单拷贝株系。我们将以水稻T-DNA插入突变体中敲除效果较显著的2个株系和超表达的2个单拷贝株系为材料对OsMADS57的功能做进一步研究。
2 材料方法
2.1实验材料
供试水稻品种：东粳背景的T-DNA插入突变体：MT1和MT2；东粳野生型。
主要试剂：Ca(15NO3)2，Trizol（Invitrogen）；atm%=40%（上海化工研究院）；逆转录酶M-MLV（Fermentas）；dNTP、Taq DNA polymerase、内切酶BamHI、SacI、T4 DNA连接酶（Takara）。
osmads57 T-DNA插入突变体的获得：来自韩国水稻突变体库。
供试菌株：根癌农杆菌和大肠杆菌均由本实验室提供。
2.2 osmads57突变体鉴定
2.2.1 osmads57T-DNA插入突变体的鉴定
无菌苗的发芽：将购得的突变体和野生型种子去皮后在超净台中于无菌三角瓶中经70%的乙醇消毒1 min，30% NaClO浸泡30 min，然后无菌去离子水冲洗6-7遍，浸泡30 min后，将种子转移到无菌吸水纸平板上晾干，最后将种子转移到1/2 MS固体培养基中。
待苗长至2叶一心，提水稻基因组DNA，采用用两轮PCR法对T-DNA插入突变体进行鉴定。osmads57 T-DNA插入突变体3个株系所用的T-DNA都是pGA2715。采用网站给出的T-DNA插入位置两侧的序列引物（F和R）以及边界引物（LB）（表1）对T-DNA突变体进行鉴定。回收鉴定为纯合体的PCR产物送去测序，通过比对T-DNA序列和OsMADS57基因序列找到每个突变体株系的插入的具体位置
T-DNA突变体敲除效果鉴定：同时采集长势一致的T-DNA插入纯合突变体和野生型水稻植株叶片提RNA反转录以插入位点两端设计引物（RT-F和RT-R）通过RT-PCR的方法鉴定（引物见表1）。
2.2.2.CRISP-CAS9介导突变体的获得
根据OsMADS57的cDNA序列，选择两个比较特异的spacer序列。CRISP-CAS9突变体载体的构建由华中农业大学王荣臣老师帮忙构建，将获得的阳性质粒电转农杆菌，用来转到冬粳（Dongjin）野生型中。经过潮霉素筛选获得T0代阳性苗，通过两轮PCR获得纯合体，第一轮PCR扩增CAS9存在的阳性苗，第二轮在Spacer序列两端设计引物（F，R）（表2），在第一轮获得的阳性苗基础上扩增含有2个Spacer的序列，将PCR产物送去测序，测序结果与cDNA序列比对，找到具体的突变位置和相关的纯合体株系种到田里，收获T1代种子