1  材料与方法
1.1  研究材料
本研究以水稻野生型日本晴(ssp. japonica cv. Nipponbare)及本实验室新发展的转基因植株(OsNAC300p:GUS;OsNAC300过表达植株)为研究材料。
1.2  研究材料培养
选取饱的水稻种子,置于自来水中黑暗条件下30°C浸泡72 hr,至种子露白;挑选露白情况一致的种子,漂浮在0.5 mM CaCl2溶液(具孔浮网)上于30°C,黑暗条件下(锡纸遮光)72 hr育根;换用1/2 木村B完全营养液培养,置于光照培养室(光照周期为:光照/黑暗=12 hr/12 hr,温度为30°C)。
1.3  试剂
1/2木村B完全营养液(终浓度,去离子水溶解 pH 5.5)
Macro elements:
KH2PO4, 0.091 mM;MgSO4•7H2O, 0.273 mM;(NH4)2SO4, 0.182 mM;
KNO3, 0.091 mM;Ca(NO3)2•4H2O, 0.183 mM。
Micro elements:
H3BO3, 3 μM;MnCl4•4H2O, 0.5 μM;(NH4)6Mo7O24•4H2O, 1 μM;
ZnSO4•7H2O, 0.4 μM;CuSO4•5H2O, 0.2 μM;Fe3+-EDTA, 20 μM。
磷酸缓冲液(pH 7.0)NaH2PO4•2H2O, 78 mM;Na2HPO4•7H2O, 122 mM;
Na2EDTA溶液 50 mM;
K3[Fe(CN)6]溶液 40 mM;
K4[Fe(CN)6]溶液 40 mM;
CdCl2溶液 50 mM;
1.4  分析检测
1.4.1  OsNAC300过表达材料镉胁迫下生长指标的测定
(1)处理。选取生长正常、一致的幼苗分组进行处理,设置0、0.5、5和50 μM四种浓度镉处理;取50 mM CdCl2加入1/2 木村B完全营养液培养中,配制四种浓度镉处理的营养液;每种浓度镉处理设置NIP、NAC300-OE5和NAC300-OE6三组,每组设置三个重复,每个重复移栽2株水稻幼苗,置于光照培养室(光照周期为:光照/黑暗=16 hr/8 hr,温度为30°C),处理72 hr。
(2)取样。将植株地下部分用5 mM CaCl2涮洗4次,擦拭干净,并用直尺测量每株水稻幼苗地上部和地下部长度。分离植株的地上部分和地下部,将每个重复的地上部分和地下部分分别放入两个牛皮纸信封中,置于80°C烘箱烘干72 hr,并称量每个重复的地上部分和地下部分干重。
1.4.2  消煮
(1)冷消煮。将称重后的样品加入已洗净、烘干的消煮管中。在通风橱中配制V(HNO3):V(HClO4) = 87:13的比例的混酸,向每根消煮管中加入5 ml混酸,并用保鲜膜封住管口,在通风橱中静置12 hr。
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