禾谷镰孢菌中6个同源FgAAT2基因敲除载体的构建及敲除突变体的获得与鉴定(2)
天冬氨酸转氨酶是转氨反应的高效催化剂，并且对细胞中氮和碳的代谢起到非常重要的作用。在模式真菌酿酒酵母中，天冬氨酸转氨酶仅由一个基因AAT2编码，在S288C菌株背景中AAT2缺失不致死，但在Sigma1278b菌株背景中AAT2是必需基因，缺失致死。S288C中AAT2基因缺失引起一系列表型缺陷[5，6]，包括生长速率下降，在富营养培养基上适合度下降，对温度敏感，且表现出对多种DNA合成抑制剂和高渗透胁迫更加敏感，表明在酿酒酵母中AAT2基因在菌体生长发育和适应外源环境过程中具有重要作用。
本论文在引起麦类赤霉病的禾谷镰孢菌基因组中通过比对鉴定到6个编码天冬氨酸氨基转移酶的同源基因，拟通过基因敲除技术研究这6个AAT2基因的生物学功能。本论文的主要内容包括6个AAT2基因敲除载体的构建，通过PEG介导的原生质体转化获得相应基因的转化子，再对转化子进行验证，获得原位插入的敲除突变体，为下一步生物学功能的分析提供材料。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验菌株与质粒
①禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1和GZ3639，菌株放于25℃培养箱培养。
②质粒pBlueScript-HPH
1．1．2 常用培养基
①PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基：
土豆 200g
葡萄糖 20g
琼脂条 20g
加dd H2O定容至1000ml，于121℃高压灭菌20分钟。
②YEPD（酵母粉蛋白胨葡萄糖琼脂）培养基：
蛋白胨 10 g
酵母粉 3 g
葡萄糖 20 g
用1 mol/L NaOH溶液 将pH值调至7.5，加dd H2O定容至1000ml，121℃高压灭菌20 分钟。
③绿豆汤产孢培养基：
绿豆 15 g
水煮40分钟后用三层纱布过滤，加dd H2O定容至1000 ml，于121℃灭菌20分钟。
④LB 培养基：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5 g
NaCl 10 g
用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.5，加dd H2O 定容至1000 ml，于121℃高压灭菌20 分钟。
⑤RM培养基：
水解溶蛋白（Casein hydrolysate） 1 g
酵母粉 1 g
蔗糖 274 g
用1 mol/LNaOH 溶液将pH值调至7.5，加dd H2O定容至1000 ml，121℃高压灭菌20 分钟。