V-ATPase复合体亚基Vph1和Stv1调控细胞自噬的机制研究(2)
细胞自噬是真核生物中高度保守的一类降解途径，它通过降解细胞内组分文持细胞内生理平衡并帮助细胞度过逆境。细胞自噬在生物体生长发育、免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制、预防神经退行性病变等方面有非常重要的作用[13]。
V-ATPase是真核生物中高度保守的质子转运复合物，它普遍存在于从酵母到哺乳动物等各类真核生物膜系统上[3]。它是一种依赖于ATP的质子泵，能够逆浓度梯度地将质子泵入细胞器，从而文持液泡（或溶酶体）、高尔基体、吞噬小泡等细胞器的酸性环境。这对液泡（或溶酶体）的消化功能、高尔基体加工蛋白质及小分子的耦合传输、膜的转运等生理活动是十分必要的[4]。
V-ATPase是一个包括14个亚基的，由V1和V0两个结构域构成的复合体[5]。水溶性的V1由A、B、C、D、E、F、G和H八种亚基组成，它位于膜表面，具有催化ATP水解的功能；而脂溶性的V0，由a、c、c’’、d和e五种亚基组成，它包埋于膜内，负责传递质子。酵母菌的V0结构域还包含一个c’亚基，而更高等的真核生物则包含附加的Ac45蛋白。V1和V0相结合时形成一个结构与功能相统一的整体。V-ATPase利用一个旋转的机制来使得质子跨膜运输[5]。
V-ATPase依赖的酸化作用在许多细胞的和生物体的进程中起着中央调节器的作用，这些细胞和生物体的进程包括细胞自噬、跨膜运输和酸碱平衡等[6]。目前已知V-ATPase在各种各样的信号转导起着重要的作用，包括Wnt、Notch等[7、8]。自噬性降解过程对于细胞的稳定性极其重要，而V-ATPase在自噬的过程中举足轻重[9]。癌变细胞能够在酸性条件下生存和生长，而产生V-ATPase的基因在癌变细胞内大量表达，参与肿瘤所生长的酸性微环境的产生，它保证了癌变细胞处在一个低而稳定的pH环境。利用V-ATPase抑制剂能够有效降低癌变细胞的侵袭与转移，因此抑制过度活跃的V-ATPase以达到抑制肿瘤的增生和扩散是有据可依的[6]。
十多年前，大隅良典与其同事[9]通过跟踪野生型和V-ATPase缺陷型酵母菌液泡内自噬体积累度，测试了是否液泡酸化是酵母菌中自噬所必需的。这项研究证实了V-ATPase的活性在细胞自噬的最后一步，降解物运送到液泡是必须的。因此，在饥饿时，V-ATPase缺陷型突变体表现出液泡内自噬体堆积，同时较野生型酵母菌而言蛋白降解下降。此外不仅自噬体内膜及内含物的降解依赖于液泡内的酸性环境，在液泡内发挥作用的水解酶也需要在酸性的环境下工作。而液泡的酸性环境的文持主要依赖于V-ATPase，当V-ATPase的功能出现问题时，液泡内pH升高，各类水解酶的活性丧失，就会导致自噬小体不能降解，细胞内物质无法良好的循环[9]。
V-ATPase在酵母细胞液泡膜上广泛存在，是液泡膜的重要组成部分，它主要负责液泡内酸性环境的文持，为生物体正常的生理活动提供了必要的条件。细胞自噬过程中，液泡是自噬体降解的场所，并且自噬体降解过程依赖于液泡的酸性环境和水解酶的活性。有研究发现V-ATPase复合体及其亚基的表达影响细胞自噬。但V-ATPase复合体亚基Vph1和Stv1单独或同时缺失对细胞自噬和液泡酸度的影响并未进行过完整详细的报道。本文通过检测了V-ATPase复合体亚基Vph1和Stv1单独或同时缺失对细胞自噬过程中的蛋白酶Pep4运输的影响、自噬蛋白Atg8的运输和降解情况来阐释V-ATPase复合体亚基Vph1和Stv1单独或同时缺失对细胞自噬的影响，并且利用能够产生串联在一起的酸稳定的红色荧光蛋白和酸敏感的绿色荧光蛋白pcRosella质粒来探究V-ATPase复合体亚基Vph1和Stv1单独或同时缺失对液泡酸度的影响。
1 材料与方法
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