重组蛋白IGF-1在人乳腺癌细胞株MCF7上的活性检测(2)
Laron综合征(LS)是生长激素受体(GHR)或受体后机制多基因缺陷的遗传病，因不能产生胰岛素样生长因子-1(IGF-1)而致病。其生化特征是循环GH水平极高，而IGF-1水平显著低下，大多数病人生长激素结合蛋白(GHBP)水平低下，分子病理学研究证实LS患者GHR存在分子缺陷。临床上应用生物合成IGF-1治疗LS儿童可加快生长速度和增加头围，减少身体肥胖，并能改善肾功能等[8]。
到目前为止，越来越多的研究已经尝试着阐明和乳腺恶性肿瘤有关的IGF-1系统分子机制。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种致有丝分裂和抗细胞凋亡的多肽,能影响乳腺上皮细胞的增生, 是促进乳腺管形成的调节因子，并在乳腺癌中起一定的作用。虽然许多于此有关的分子途经和胞内反应仍有待阐明，但是越来越多的证据指出了IGF-1系统在乳腺癌发育、发展和新陈代谢中起到重要的作用[1]。实验数据证明，正常小鼠乳腺上皮细胞可以在含IGF-1的无血清培养基中进行增殖，这表明了IGF-1系统在乳腺功能和文持中扮演重要的角色。在过去的20年里，许多研究证明了包括乳腺癌的几种恶性肿瘤发育与IGF-1系统有关。的确，乳腺肿瘤可能异常表达IGF-1系统中的每一种成分，促进细胞的增殖[1]。
综上，IGF-1与多种疾病的发病机制有关，其目前已成为医学研究的热点之一。通过基因工程技术可在体外大量生产重组蛋白，我们通常需要的是具有生物学活性的重组蛋白，为了鉴定本公司生产的IGF-1是否具有生物学活性，我们检测了其在体外对MCF-7细胞增殖的影响。
1.实验材料
1.1细胞株：
MCF7: 由协和细胞中心提供，所用培养基为：F12/DMEM+5%FBS。
1.2实验仪器
表1实验仪器
名称 生产厂家 型号
台式低俗离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司 3C-3612
东亚牌液氮容器 乐山市东亚机电工贸有限公司制造 yDS-100-200F
电热式恒温水浴锅(箱) 天津欧诺仪器仪表有限公司 SY-2-4
磁力搅拌器 上海司乐仪器厂 Feb-95
CO2培养箱 Thermo Fisher Scientific 3111
生物安全柜 上海瑞仰净化装备有限公司 BBS2A2-1602
倒置显微镜 尼康仪器(上海)有限工司 XDS-1B
1.3实验试剂
磷酸盐缓冲液(1×PBS)，胰酶(1*trypsin)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，台盼兰，F12/DMEM培养基，牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)，噻唑蓝(MTT)，三联液，二甲基亚砜(DMSO)
2.实验方法
2.1 MCF7细胞培养
2.1.1细胞复苏
①将取出的细胞于水浴锅中解冻，过程中不断摇动使其迅速解冻。
②迅速将解冻细胞喷洒酒精后拿到生物安全柜中，将管口拧松，用5ml移液管将细胞从冻存管移入对应名称的离心管中，800r/min离心5min，除去冻存液中的DMSO。
③离心后弃去上清，用5mL新鲜培养基重悬后移入T25，将瓶口拧紧，拿出生物安全柜，喷洒酒精，放入CO2培养箱中把瓶口拧松，静置培养。
2.1.2细胞传代
①将T25放置在倒置显微镜下观察细胞，当细胞丰度达到80%-100%后传入T75，且传代需于生物安全柜中进行。
②将培养基顺着T25细胞生长面倒入废液收集杯中。
③取5ml无Ca、 Mg离子的PBS放入培养瓶中洗涤细胞生长表面，废液弃至废液杯中。
④取1ml胰酶浸润全部细胞表面，后吸出0.7-0.8mL胰酶，剩余0.2-0.3mL胰酶使细胞消化完全。
⑤倒置显微镜下观察细胞单层是否已经分开，并轻拍细胞生长侧，加入6-8mL完全培养基终止消化，并用移液管吹打细胞使其脱离培养瓶表面。
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