图1 不同组蛋白末端位点修饰类型[3]

  Figure1 Different types of histone terminal site modification

1  材料与方法 

1．1  ChIP-Seq技术

染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）是被广泛应用于研究DNA和蛋白质相互作用的方法。ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子（Transcription factors ，TFs)。近年来，ChIP成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。ChIP-Seq是ChIP技术结合NGS技术进一步确定染色质免疫共沉淀实验得到的DNA样品的序列。其序列可以通过直接测序确定[4]。

1．1．1  ChIP的原理

在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，再通过多种下游检测技术（定量PCR、基因芯片、测序等）来检测此富集片段的DNA序列。此步骤获得全基因组范围内与组蛋白或转录因子等DNA结合蛋白相互作用的DNA区段信息，这些DNA区段信息的长度大约为200 bp。用新一代的测序技术测序获得36~100 bp的DNA片段的序列，最后这些DNA片段将会被比对到对应的参考基因组上[5]。

1．1．2  ChIP步骤

染色质免疫共沉淀技术包括3个独立的步骤，即固定、沉淀和检测。第1步为固定，即在体内用甲醛（HCHO）固定DNA和蛋白质复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切成一定长度的染色质小片段（200～1000bp）。第2步为免疫沉淀，即利用目的蛋白质或者目的蛋白质上标签的特异性抗体，通过抗原和抗体反应形成DNA－蛋白质－抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。第3步为目的片段的纯化与检测，即经过热处理解交联，释放共沉淀的DNA；再将DNA片段纯化后，对沉淀的DNA样品进行检测。如下图所示。

1．2  NGS技术

NGS就是Next Generation Sequencing，又称“下一代测序技术”或者是“第二代测序技术”。相对于第一代测序Sanger其测序通量有了很大的提升，读长变短，需要打断测序，高效率，低成本。二代测序比较常见的有罗氏454测序，Illumina等。但目前最为常用的NGS技术就是Illumina测序技术，它能够保证在几十个小时内产生几百G甚至上T（1T=1024G，1G=1024M）的测序数据，完全能够满足高通量测序的通量要求。

1．2．1   Illumina测序原理

Illumina测序分4步：文库制备，簇生成，测序，数据分析。

1．2．1. 1  文库制备

文库制备的具体流程因样本种类和测序目的的不同而不同，但是大同小异，基本过程是把长链DNA随机打断成短片段，两端接上通用引物，留下两端连接完整的产物，去掉残缺不全的再进行10-12个循环的PCR，使产物富集。

1．2．1. 2   簇生成    

第一步，将上述的DNA样品调整到合适的浓度加入到flowcell中，再加入特异的化学试剂，就可以使得序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过化学键十分强健地相连，有两种不同的adpater，adapter有两种引物序列分别是测序时要用的引物序列和扩库PCR要用的引物序列。

第二步，连接以后就正式开始桥式PCR。首先进行第一轮扩增，将序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱。由于最开始的序列是使用化学键连接的，所以不会被洗。