喜树种子中含有的主要营养物质为蛋白质、糖类物质和脂质。这些储藏物为喜树种子萌发提供必需的能量，并在此过程中发生一系列的变化。本文旨在通过组织切片技术和细胞化学方法，观察喜树在种子萌发时期胚乳细胞中的组织化学变化，尝试寻找细胞内蛋白质、糖类和脂质的降解规律，阐明其与种子萌发率之间的关系，为喜树的快速育种，资源的保护和开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1植物培养与处理

喜树种子于2014年11月采自杭州师范大学仁和社区15幢前，经通风晒干后用塑料袋密封常温保存。

在1月12日挑选300粒左右的饱满种子，于25-35℃温水中浸泡24小时，次日分两组播种，自然环境萌发30天。萌发过程中视需要浇水，基本为自然生长。一组用于计算喜树种子萌发率，另一组用于取样观察。

1.1.2 取样

每天观察记录喜树种子的萌发情况及形态学变化，观察期间每隔5天取样于FAA中固定，每次取样4颗种子。以只经过24h温水浸泡处理的种子为对照。在对种子脱水前将种皮剥去，仅留胚乳和胚，部分样品胚已去掉，仅留胚乳部分。为脱水更加充分，用小刀将其切成2-3段不等，分别用于观察蛋白质、糖类和脂质的存在情况。

1.2方法

本次实验主要采用石蜡切片的方法结合组织化学染色技术展开对喜树种子萌发时胚乳细胞内组织化学变化的研究。主要经历以下几个环节：取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、封片、镜检并拍照。用考马斯亮蓝染色法显示喜树种子萌发各时期胚乳细胞中的蛋白质，用PAS染色法显示糖类物质[12]，用苏丹Ⅳ染色显示脂类物质。

脱水和透明：将已固定于FAA中的种子取出，用小刀切成不等小段，放入小指管，依次将固定液替换成浓度逐级递增的酒精溶液中，并处理不同的时间，分别为70%、85%、95%酒精2小时，纯酒精更换3次，每次30分钟，其中70%和85%酒精各抽气一次。之后换为1/2纯酒精和1/2二甲苯，并加番红少许，处理2小时，最后换两次二甲苯，每次1小时。

浸蜡和包埋：在之前已透明处理的小指管中加入与二甲苯同体积的石蜡，加上盖子放于37℃恒温箱中一天，一天后打开盖子放在60℃恒温箱中让二甲苯慢慢蒸发，前两次每隔3小时更换纯蜡，第三次更换纯蜡后放置18小时。浸蜡结束后将材料转移到装有液态石蜡的小纸盒中论文网，用温镊子夹取材料放于纸盒中部，摆放整齐，把纸盒缓慢平放在冷水表面，待表面凝固后沉入水底，使其迅速冷却。

切片和贴片：将包有材料的石蜡取出，修正成形状规则的长方体小块，靠近酒精灯加热一会儿使底部的蜡部分融化并迅速粘在长方形木块上，调整切片机厚度为8μm，对不同萌发 时期的喜树种子胚乳进行横向连续切片。取干净载玻片于盐酸酒精中浸泡4-6小时后转入95%酒精中保存`优尔|文\论*文-网www.youerw.com，使用时取出载玻片在酒精灯上烧一下，水平置于洁净桌面，将切好的蜡片整齐排列放上载玻片，滴一滴蒸馏水使蜡片展开，于37℃烤片机上烘干。

脱蜡：将已烘干的切片放于二甲苯中10分钟，更换一次二甲苯直至蜡脱尽。

考马斯亮蓝染色：将脱蜡后的切片放入1/2酒精和1/2二甲苯中10分钟后，换成浓度逐级递减的酒精溶液，分别为纯酒精、95%、85%、70%、50%、30%、蒸馏水，每次5-10分钟，其中纯酒精浸泡两次。蒸馏水中取出切片放于7%醋酸溶液1-2分钟后用考马斯亮蓝R250染色15-30分钟，最后用自来水冲洗5分钟，切片干燥，中性树胶封片。