摘要以已制备的苦苣菜黄网病毒(Sonchus yellow net virus，SYNV)高特异性的4D1单抗为一抗，建立的间接ELISA检测方法。其最适工作浓度是抗原P和单抗稀释度分别为1:4000和1:16000。检测纯化P蛋白和SYNV病汁液的灵敏度分别为0.188 µg/mL和1:320。4D1单抗可成功检测出通过植物真核表达载体浸润接种而在烟草中表达的P蛋白。实验结果表明所制备的单抗与p蛋白具有高度的特异性，不仅能用于检测p蛋白，而且能够检测SYNV病毒。46760

毕业论文关键词：苦苣菜黄网病毒；ELISA；单克隆抗体；检测

Abstract

An indirect enzyme-linked immunosorbant assay (id-ELISA) method based on MAb from cell lines 4D1 was set up for P protein detection, and id-ELISA optimal working dilution was antigen P dilution of 1:4000，monoclonal antibody dilution of 1:16000. MAb from cell lines 4D1 could successfully detect 0.188 µg/mL purified P protein or SYNV virus in plant sap at 1∶320 dilution. MAbs from cell lines 4D1 was capable of testing the P protein expressed in tobacco plants through infiltration inoculation by the eukaryotic expression vector of plant .The experimental results indicated there were high specificities between the prepared monoclonal antibody and P protein. The MAb was applicable to specifically detect not only P protein but also SYNV virus.

Keywords: Sonchus yellow net virus; ELISA; monoclonal antibody; detection

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引言 4

1.材料 6

1.1材料 6

1.2试剂 6

1.3仪器 6

1.4 试剂配制 6

2.方法 7

2.1间接ELISA最适工作浓度的测定 7

2.2间接ELISA检测P蛋白的灵敏度 7

2.3间接ELISA检测SYNV病汁液的灵敏度 8

2.4间接ELISA检测在烟草中表达的P蛋白 8

2.4.1制备根癌农杆菌GV3101感受态细胞 8

2.4.2转化农杆菌 8

2.4.3浸润接种本氏烟 8

3.结果与分析 9

3.1单抗及包被原最佳工作浓度的确定 9

3.2间接ELISA检测P蛋白的灵敏度 10

3.3间接ELISA检测病汁液的灵敏度 10

3.4间接ELISA检测在烟草中表达的P蛋白 12

3.4.1农杆菌转化菌液PCR鉴定 12

3.4.2检测在烟草中表达的P蛋白 12

3.5间接ELISA检测自然侵染、真核表达和原核表达的P蛋白 13

4. 讨论 13

参考文献 14

 引言

植物病毒对农业生产有着极其重大的危害，目前引起植物病害的病毒已被发现超过700多种，如果一旦发生病害，就会给农业作物的产量和质量带来严重的损失[1-2]。植物病毒的防治主要通过加强田间管理，使用病毒钝化剂，还有常规的治虫防病等生态防护方法进行，此外，脱毒种苗的使用和田间病源的清除也是有效的防治手段。然而，防治植物病毒病害最有效的方法就是建立高效的病毒鉴定和检测技术，所以建立有效便捷的病毒检测方法显得尤为重要[3]。