2.2. RT-PCR检测ORSV沉默载体处理的本氏烟 3

2.3. ORSV沉默载体与病汁液共处理本氏烟植株生长状况 3

2.4. 半定量PCR（sq RT-PCR）检测本氏烟体内病毒CP基因的表达量 4

3. 讨论 5

参考文献 7

致谢 8

引    言

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）是严重危害兰科植物的主要病毒之一。它由正义的单链RNA和衣壳蛋白（coat protein,CP）组成，其核酸大小约为6618bp,编码5个开放阅读框（ORF），181KD的通读蛋白，126KD的复制酶，17.3KD的外壳蛋白,34KD移动蛋白和一个52KD的未知蛋白，而外壳蛋白上包被了核酸形成长的杆状病毒粒子。齿兰环斑病毒具有机械传播的特点，可接触传染，无需媒介，传染性极强[1-3]。齿兰环斑病毒侵染兰花后，会导致兰花叶片产生黄化条纹或不规则绿色斑块，花部甚至出现畸形或褪色斑，红色系花朵尤其明显[4]。因而齿兰环斑病毒侵染兰花后会使其观赏价值和经济价值大大下降。目前，针对此病毒无特效治疗措施，我们主要以防治为主。

而为了减少或解决齿兰环斑病毒的危害性，即防御齿兰环斑病毒，其关键在于抗病毒兰花。为了从根本上选育抗病毒兰，基因工程技术是首先将抗病毒基因整合到病毒寄主中，以期获得对ORSV的永久抗性。在进行基因工程实施过程中，其上游工作意义重大，直接关系到转基因植株的表达效应，如基因分离、提取，载体构建、纯化和富集化。本研究的载体是利用RNA沉默机理构建的抗病毒载体，理论上能更有效地提高寄主的抗病毒效应。

在本研究中，我们主要通过四方面来研究齿兰环斑病毒RNA沉默载体的瞬时表达效应，分别为通过齿兰环斑病毒RNA沉默载体接种到模式寄主（本氏烟）上，检测此沉默载体介导的抗病毒效应；RT-PCR检测沉默载体浸润后的本氏烟，在无病毒基因组下的富集情况；检测载体和病毒共接种后模式寄主本氏烟的症状效应；感病兰接种沉默载体后的外壳蛋白的检测结果。

通过研究，我们期望可以提高病毒RNA干涉载体的抗病毒有效性，提高后期转化效应和转基因株的抗病效应。因而，我们将齿兰环斑病毒ORSV干涉载体在模式寄主烟草中进行农杆菌浸润接种和瞬时表达，对寄主发病症状、病毒体内富集以及病毒基因的表达进行分子鉴定和研究，以检测构建载体的抗病毒效应。最终希望能获得有效的沉默载体用以抗ORSV基因工程的研究和抗病毒株制备。

就目前而言，针对于齿兰环斑病毒的研究，主要集中于其检测方法。从最初只是通过鉴定病毒的寄主范围，病症，介体范围等方法鉴别病毒的种类，到目前在分子水平上研究鉴定病毒，如生物学检测法、电镜观察、血清学检测和分子生物学方法，而其中分子生物学方法有可分为核酸杂交检测方法和RT-PCR扩增等[5]。此外还有关于齿兰环斑病毒RNA沉默表达载体的研究及制备，为该兰花病毒的诊断、兰花抗病育种和脱毒苗的建立打下基础。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

感病毒兰、野生型本氏烟、农杆菌菌种（GV3101）、植物表达载体pXGY1、齿兰环斑病毒RNA沉默载体和一些相关的分子生物学试剂。

1.2. 载体菌复苏

将含有齿兰环斑病毒(ORSV)RNAi载体的农杆菌细胞悬液涂布在含（卡那霉素）Kan 、（利福平）Rif 、Chl（氯霉素）的固体LB培养基上，在28℃温度下培养。2天长出单克隆菌落，挑出单克隆接种于含有同样抗生素的LB液体培养基中，于28℃，220r/min条件下培养至对数期。