1.2.5样品纯化 9

1.2.6 连接方法 10

1.2.7 热击转化法 10

1.2.8 重组质粒PCR 11

1.2.9 质粒抽提 11

1.2.10 重组质粒酶切鉴定 12

第二章 植物RBR基因干涉及过表达载体的构建 13

2.1 植物RBR基因干涉载体的构建 14

2.1.1 本氏烟总RNA的提取及CDNA的合成 14

2.1.3 获得目的基因的PCR产物（通用的引物） 15

2.1.4 PCR产物的纯化 15

2.1.5 一步法构建干涉载体LIC的反应步骤 15

2.1.6 将干涉载体LIC的连接产物转化至感受态大肠杆菌中 16

2.1.7 RBRi-RNAi-LIC重组质粒的检测与获得 16

2.1.8 质粒抽提 16

2.1.9 质粒的酶切验证 16

2.1.10 RBRi-RNAi-LIC重组质粒的测序检测 16

2.2 植物RBR基因过表达载体的构建 18

2.2.1本氏烟总RNA的提取及CDNA的合成 18

2.2.2获得目的基因的PCR产物 18

2.2.3 PCR产物的纯化 18

2.2.4 用双酶切KPN I 和Sal I 消化目的PCR产物 18

2.2.5 用双酶切KPN I和Sal I消化PCAMBIA 2300空载 18

2.2.6 T4连接酶连接载体与片段 18

2.2.7 连接产物转化 19

2.2.8 挑选单克隆，摇菌过夜培养 19

2.2.9 质粒抽提 19

2.2.10 重组子验证 19

2.2.11 RBR过表达质粒的测序检测 19

第三章 RBR干涉及过表达基因载体转化普通本氏烟 20

3.1 RBR载体质粒电转导入农杆菌 20

3.2 转基因RBR愈伤组织的获得 20

3.3普通烟草叶片的准备 20

3.4 预配养 20

3.5 农杆菌的培养 20

3.6 农杆菌侵染 20

3.7 共培养、筛选培养、继代培养 21

3.8 生根培养 21

第四章 实验结果分析 22

4.1 RBR基因干涉载体的构建结果 22

4.1.1获得目的基因的PCR产物电泳检测 22

4.1.2 挑选RBRi-RNAi-LIC重组子的PCR电泳检测 22

4.1.3 质粒的酶切验证电泳检测 23

4.2 RBR基因过表达载体的构建结果 23

4.2.1获得目的基因的PCR产物电泳检测 23

4.2.2 用双酶切KPN I 和Sal I 消化目的PCR产物电泳检测 24