水稻种子活力相关基因OsIPMS12的功能分析(2)
种子活力是指在广泛的田间条件下，决定种子迅速整齐出苗和长成幼苗潜在能力的总称[7]。种子活力形成于种子发育的脱水阶段，随着种子成熟，体内的蛋白质、淀粉等物质逐渐积累，种子发芽率和活力逐渐提高，至生理成熟期达到高峰，此时，表现出最高的种子发芽率及活力[8]。高活力种子发芽早、出苗整齐且迅速，对不良环境的抵抗能力较强，具有明显的生长优势和生产潜力优势；低活力种子在适宜的生活条件下虽然能够发芽，但是发芽速度缓慢，在不良生活环境条件下出苗不整齐，有时甚至不出苗[9]。种子活力的高低是由遗传因素、种子发育期间的环境条件及种子贮藏条件3个方面共同决定，另外收获脱粒时的机械损伤也会对种子活力造成影响[10]。种子活力受到很多因素影响，是一个非常复杂的综合性状，表现在发芽率、苗长、根长、鲜重、干重等诸多方面[11]。目前，关于水稻种子活力已克隆了SKC1、OsVP1、qLTG3-1、Sdr4、OsFbx352和Qsd7-1/qPC7等7个基因，分别位于1、3、7和10等4条染色体上[12]。
以往研究结果表明太湖流域稻种资源韭菜青是强耐盐地方品种，以太湖流域粳稻品种韭菜青为材料，利用蛋白双向电泳技术，在150mM盐胁迫下筛选了不同萌发阶段显著差异表达蛋白。通过对差异倍数大于2的19个蛋白进一步进行质谱鉴定，其中一个蛋白由OsIPMS12基因所编码。该基因定位于水稻12号染色体上，因此本研究将该α-异丙基苹果酸合酶基因暂命名为OsIPMS12。α-异丙基苹果酸合酶（IPMS）是微生物亮氨酸和异撷氨酸合成途径中起催化作用的第一个酶，该酶不仅催化α-酮异戊酸生成α-异丙基苹果酸，并且α-酮丁酸也是它的催化底物，对动植物生命活动都具有重要作用[13]。
本研究利用点突变材料，过量表达等转基因株系,源^自#优尔^文~论`文]网[www.youerw.com，对其正常条件及盐胁迫条件下的发芽速度及种子的根长和芽长进行鉴定。利用生物信息学方法分析其组织表达和发育过程中表达模式，从而初步分析了OsIPMS12在种子萌发过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料准备
前期实验室利用CRIPSR-Cas9技术构建了该基因的点突变体，通过农杆菌介导转化的方法获得OsIPMS12的过量表达转基因株系及启动子活性分析GUS转基因株系。经过筛选获得阳性纯合转基因株系T2代，同时选择3-5个稳定株系进行扩繁，收获成熟种子，储存于-20 ℃冰箱，以备后期试验。
1.2 RNA的提取
提取RNA 所用的器皿、研钵、镊子等用酒精灼烧5-10 min，其他器皿均用0.1%的DEPC水处理后高温高压灭菌两次以去除RNA酶，所有试剂都保证没有RNA酶污染。
1) 1.5 mL离心管中加入1 mL Trizol，取0.1g组织在液氮中研磨至粉末，加入到Trizol中，立即充分混匀。（或保存在-80℃，用时只要离心管中的液体融化完全）
2) 加入250 μL氯仿，混合均匀，然后置于冰上10 min。
3) 4 ℃，13000 rpm 离心10 min，之后至于冰上。
4) 取上清至于新的1.5mL的离心管中，之后加500μL异丙醇，混匀，室温放置10 min。
5) 4 ℃，13000 rpm 离心10 min，去上清，管底管侧形成胶状沉淀。
6) 加 1 mL 75%乙醇，混合均匀，洗涤沉淀，洗涤用4 ℃，13000 rpm 离心10 min，弃上清，室温风干约5 min。
7) 加 30-40 μL DEPC处理的水（可以用枪头混匀），之后-80 ℃保存。
注意：提取RNA之前，先把移液枪、放离心管的板子和手套用酒精消毒。
1.3 RNA反转录
cDNA第一条链的合成
试剂名称 试剂量（μL）
Rnase free ddH2O
Oligo dT23 VN (50 μM)
Total RNA 8