因此研究甘薯地里的微生物对甘薯苗生长的影响很有必要。有促进作用的菌制成菌肥不仅可以减少化学肥料的使用，改善土壤环境，而且可以提高甘薯产量和质量，有抑制作用的菌可以研究菌之间的拮抗作用，为微生物基础学的完善作出贡献，本文采用微生物纯培养方法以及分子生物学方法PCR等对不同品种的甘薯根系土壤微生物进行了分离与鉴定，主要技术包括土样采集、菌种分离筛选、总基因组提取、PCR、胶回收、16S rDNA测序[6]，采用EzTaxon 软件对基因库中基因序列进行同源性比较,采用MEGA5.1软件对相似性序列进行系统发育分析研究并构建系统发育树分析菌种的同源性等。

1 材料与方法

1．1  实验材料与试剂

1.1.1土壤采集区概况

汉王镇，属山区丘陵地带，位于徐州的西南部，其与安徽的群山相接壤，东部紧邻徐州铜山新区，汉王镇的生态旅游资源比较丰富，自然环境良好，大气质量达到一级标准。

1.1.2 样品采集与处理

2013年5月中旬，在徐州汉王附近农田地表以下5—10cm取土适量，取的土样装入消过毒的采样袋中并编号记录，样品带回实验室后用孔径为2 mm×0.25 mm的钢筛筛去除大块的土壤，重复筛选三次得到细小的土壤颗粒（-20 ℃保存备用）用于土壤微生物分子实验。

1.1.3 实验器材

    无菌的聚乙烯袋、钢筛、烧杯、培养皿、摇床、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、移液枪、接种环、玻璃刮刀、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪、水浴锅、离心机、电子天平、电磁炉、超净台、锥形瓶、紫外成像仪等。

1.1.4 主要试剂及引物

LB固体培养基：氯化钠、蛋白胨、酵母粉、琼脂粉；

MS培养基：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液、MS有机物母液、蔗糖、琼脂；

    PCR产物纯化试剂盒：2*Taq Master Mix、ddH2O、通用引物F27[7]： AGAGTTTGATCATGGCTCAG、R1492：CTACGGTTACCTTGTTACGAC、DNA  Marker  (DL 2000)；

琼脂糖凝胶的配置：琼脂糖1g，Goldviewna ITM 型染料0.6 ul，1X TAE 定容至100ml

1.1.5培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃ 灭菌20 min．

1．2  实验方法

1．2．1 土壤菌悬液的制备

将从采样地三个区域取回的三袋土壤样品混匀，用孔径为2 mm×0.25 mm的钢筛筛去大块的土壤团块，重复筛选三次，得到细小的土壤颗粒，准确称取1g土壤样品，置于灭菌的99ml的生理盐水中，摇床摇晃8小时，使土壤微生物（主要为细菌）充分分散，此时为浓度为10-2的菌悬液，静置3 h使土壤沉淀充分。在无菌超净台内，用移液枪吸取0.5ml的10-2的菌悬液，转移到装有已灭菌的4.5ml生理盐水的试管内，此时为浓度为10-3的菌悬液。同样步骤稀释以上菌液，配制一系列浓度梯度的菌悬液，浓度依次为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。

1．2．2 土壤细菌数量的统计

土壤微生物(只计细菌)的菌群数量单位为cfu/g 干土，数量采用平板稀释涂布方法测定源!自`优尔'文"论(文`网[www.youerw.com。在超净工作台内，用移液枪从配制的各浓度梯度的菌悬液中分别吸取0.5ml菌悬液，转移至LB固体培养基表面，用灭过菌的玻璃刮刀在培养基表面涂布均匀，每个浓度设置3个重复，在培养皿表面标注浓度，将培养皿倒置于恒温培养箱中，温度设置37℃，培养8小时。观察菌形态，选取菌落数在60-200个的培养皿进行计数。

1．2．3 菌种的分离与纯化