致谢 18

引  言

自国外学者通过16S rRNA基因测序和生物标记法在高温油井[1]及深海热泉[2]等处发现AnAOB之后，高温AnAOB的研究又开启了新篇章。

温度作为微生物生长的一个环境因子，对微生物代谢活动尤为重要。AnAOB对温度变化较敏感，一旦偏离最适范围，会显著影响细菌的活性。同时，温度也是Anammox混培体系中微生物的筛选条件，影响着Anammox混培体系微生物群落和数量的变化。目前已知的AnAOB以中温菌居多，能进行Anammox反应的温度范围是6-43℃[3]，最佳范围是30-40℃，随着温度的升高，AnAOB的生物活性先升高后降低[4]。低温和高温均会影响AnAOB的活性，低温条件下AnAOB可能保持较高活性，但是高温对AnAOB却是致命性的伤害，高温会影响AnAOB的酶活和蛋白质的热稳定性，使AnAOB面临着菌体死亡的危险，从而导致其活性丧失。

实际废水处理中AnAOB生长的最高温度为43℃[5]；Toh等[6]等研究认为高温（55℃）AnAOB无法富集；Dosta等[7]发现AnAOB经过 45℃培养几个小时后其细胞裂解，活性完全丧失；同样，Liu等[8]发现48℃冲击1个小时后AnAOB发生不可逆的死亡；Eduardo等[9]46℃培养8 天后经过70 天能恢复到冲击前的活性。因此，AnAOB对高温的敏感性决定了其高温富集的难度系数。

然而，Courtens等[10]研究发现，适当增加盐度可提高中温硝化污泥的耐高温能力，同时，Vyrides等[11]研究表明相容性溶质（如5 mM的甜菜碱）可以提高厌氧微生物的耐盐能力，甜菜碱能够在微生物细胞内积累抵抗细胞外部的高渗透压，起到保护细胞的作用，可以自身合成，也可以通过添加获得。Liu等研究盐度胁迫下相似相溶性物质添加对AnAOB活性的影响，发现甜菜碱浓度在1 mM时的解毒效果最佳。据此，甜菜碱添加是否可以提高盐度对高温的缓解作用以及甜菜碱对高温胁迫下AnAOB的活性是否有影响，这些相关问题亟待解决。

本实验拟研究甜菜碱添加对高温条件下AnAOB活性及脱氮效率的影响，同时运用qPCR技术以期从微观层面解析混培物中AnAOB的数量的变化，为高温AnAOB的富集培养寻找新思路。鉴于高温量化分类标准一直存有争议，而且它随微生物的种类而不同，因此，本文中所限定的高温是指长期生存温度为45℃。

1、材料和方法

1.1材料

1.1.1 实验装置

受试Anammox反应装置为两个相同上流式厌氧污泥床反应器（UASB）T0和T1，其中T0为对照反应器，T1为受试反应器。反应器包括进水缓冲区、升流式反应室以及三相分离区三部分。反应器有效体积为1.0 L，并覆盖黑布以避免光照。qPCR采用的仪器为iCycler iQ5（Bio-Rad，California，USA）。

1.1.2 菌种

接种菌源取自35℃培养成熟的AnAOB混培物，反应器总悬浮物浓度（SS）和挥发性悬浮物浓度（VSS）分别为27.7和15.9 g L-1。

1.1.3 模拟废水

T0和T1反应器进水基质的组成为：(NH4)2SO4、 NaNO2、无机盐溶液和微量元素，溶剂为水。(NH4)2SO4和NaNO2按所需浓度配制；无机盐溶液包括：10 mg L-1 KH2PO4、5.6 mg L-1 CaCl2·2H2O、300 mg L-1 MgSO4·2H2O、1250 mg L-1 KHCO3；微量元素包括：EDTA (15 g L-1), ZnSO4·7H2O (0.43 g L-1), CoCl2·6H2O (0.24 g L-1), MnCl2·4H2O (0.99 g L-1), CuSO4·5H2O (0.25 g L-1), NaMoO4·2H2O (0.22 g L-1), NiCl2·2H2O (0.19 g L-1), NaSeO4·10H2O (0.21 g L-1), H3BO4 (0.014 g L-1)和FeSO4·7H20 (9.14 g L-1)。源^自·优尔|文\论]文'网[www.youerw.com

1.2方法

1.2.1   高温条件下甜菜碱的短期添加（批次实验）

取培养成熟的厌氧氨氧化颗粒污泥进行批次实验，用无机盐溶液清洗后分装入血清瓶，每个血清瓶中厌氧氨氧化颗粒污泥约10 mL，共5个血清瓶，R1为对照组（不添加甜菜碱），R2~R5为实验组（依次添加甜菜碱的含量为0.1、1、5、10 mM）。血清瓶中氨氮和亚硝氮初始浓度均为100 mg/ L，其余组分与模拟废水一样，调节pH至7.5左右，通入氩气曝气20 min排出其中的氧气确保厌氧环境[12]。之后用丁基橡胶塞密封置于180 rpm，在45℃下振荡培养，每隔一个小时取一次样测定亚硝氮含量。然后每隔一定时间取一次污泥样，共5~7个样，取样结束后测定悬浮固体（suspended solid，SS）及挥发性悬浮固体（volatile suspended solid，VSS），算出SAA值（基质消耗速率与污泥浓度的比值即为SAA值）。初步了解最佳甜菜碱添加浓度。