荧光法以其选择性好、灵敏度高、操作简便等优点受到分析工作者的青睐。荧光光谱法是研究生物大分子，特别是白蛋白与各种有机小分子、离子和无机化合物相互作用的重要手段。有关蛋白质的结构和功能研究，是目前生命科学、化学和医学界共同关注和感兴趣的课题[4]。血清白蛋白能够与许多内源性及外源性化合物结合，是药物发挥药效的重要载体和靶点[5]。本文采用荧光法和紫外-可见分光光度法研究了人体生理 pH 值条件下，替莫唑胺与牛血清白蛋白之间的相互作用，测定了结合常数、结合位点数，从而由分子水平的角度认识蛋白质分子与药物分子之间相互作用的机理，为生命科学提供了有效的数据和信息。

 替莫唑胺的化学结构。

Fig.1 The chemical structure of temozolomide.

2  实验部分

2.1  试剂和仪器

Perkin Elmer LS55 荧光分光光度计(英国)，使用1 cm石英比色皿；TU 21901 (日本岛津) 。

配置 1.0×10-4 mol·L-1 牛血清白蛋白 (BSA) (上海惠兴生化试剂有限公司)作为储备液保存于 0～4 ℃，使用时适当稀释；配置 1.0×10-3 mol· mL-1 替莫唑胺(哈尔滨制药总厂)作为储备液保存于 0～4 ℃，使用时适当稀释；pH = 7.4 的 Tris (三羟甲基氨基甲烷)缓冲溶液；其余药品均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

2.2  实验方法

2.2.1  BSA的荧光光谱

10 mL比色管中依次加入 100 μL BSA 储备液、不同量的替莫唑胺储备液、2 mL pH = 7.4 的 Tris 缓冲溶液、2 mL 0.1 mol·L-1 NaCl 溶液，二次水定容，放置 30 min，在 λex/λem = 280/350 nm，扫描 BSA 的荧光光谱及在替莫唑胺作用下的荧光猝灭光谱。在 Δλ = 15 nm和 Δλ = 60 nm 时扫描酪氨酸和色氨酸的同步荧光。1 cm 比色皿，激发和发射狭缝均为5 nm。

2.2.2  替莫唑胺的荧光光谱

10 mL 比色管中依次加入 100 μL 替莫唑胺储备液、不同量的 BSA 储备液、2 mL pH = 7.4 的 Tris 缓冲溶液、2 mL 0.1 mol·L-1 NaCl 溶液，二次水定容，放置 30 min，在 λex/λem = 255/350 nm，扫描替莫唑胺在 BSA 作用下的荧光光谱。1 cm 比色皿，激发和发射狭缝均为5 nm。源^自·优尔·文.论,文'网]www.youerw.com

2.2.3  紫外吸收光谱

10 mL 比色管中依次加入不同量的替莫唑胺储备液、2 mL pH = 7.4 的 Tris 缓冲溶液、2 mL 0.1 mol·L-1 NaCl 溶液，二次水定容，在紫外-可见分光光度计上扫描替莫唑胺的紫外吸收光谱。1 cm 比色皿，试剂空白为参比。

3  结果与讨论

3.1  pH 对反应体系的影响

在一系列 10 mL 比色管中分别加入 100 μL 替莫唑胺、1 mL BSA 溶液、2 mL 0.1 mol·L-1 NaCl 溶液，另外加 2 mL不同的缓冲溶液(分别为 pH 为 3.0、5.0、7.0、9.0 的 Britton-Robinso 缓冲溶液、Clark 缓冲溶液以及 pH 为7.0、9.0 的 Tris 缓冲溶液)测定。设定激发和发射狭缝宽度均为 5.0 nm，激发波长为 280 nm，在 290 nm 到 500 nm 范围内扫描荧光猝灭光谱。

结果表明替莫唑胺结合 BSA 后在酸性条件下荧光强度较弱，当 pH 升高至 5.0 时，二者荧光强度明显升高。在 pH 接近中性时，二者作用最强，随后二者作用逐渐下降。考虑到 BSA 在人体生理 pH 条件下活性最大，所以选择 pH 为 7.4 的条件下进行测试。

3.2  替莫唑胺与 BSA 的荧光光谱

3.2.1  替莫唑胺对BSA的荧光猝灭光谱

模拟生理环境，选用 pH = 7.4 的条件，研究替莫唑胺与 BSA 的相互作用。蛋白质的内源荧光主要来自于分子中的色氨酸残基和酪氨酸残基。在实验条件下保持 BSA 的浓度不变，改变替莫唑胺的浓度，测得不同浓度替莫唑胺时的 BSA 的荧光光谱，如图2所示。由图2可见，随着替莫唑胺浓度的不断增加，BSA 在 350 nm 处荧光发射峰强度有规律减弱，说明替莫唑胺对 BSA 的荧光有猝灭作用，二者之间存在相互作用。并且最大荧光发射峰发生红移，从 350 nm 红移至 355 nm 左右，这表明 BSA 中 212 位色氨酸残基附近亲水性增强。