弹性蛋白酶psudolysin是由Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）产生的弹性蛋白酶，又名Pseudomonas aeruginosa elastase（PAE），它是一种以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的广谱蛋白水解酶[1]。该酶在铜绿假单胞菌中由lasB基因编码是一种中性锌金属蛋白酶，需结合锌离子发挥其活性，结合钙离子维持其稳定性。lasB基因全长1497bp，编码498个氨基酸。弹性蛋白酶是一种胞外蛋白酶, 在细胞质中以弹性蛋白酶原前体的形式存在, 在穿过内膜时，信号肽被切割分泌到胞外后，蛋白酶自我切除前导肽，成熟产物为301个氨基酸，分子量为33kDa。弹性蛋白酶在可以降解自然界中化学性质稳定的蛋白类物质：比如，动物弹性蛋白、动物毛发、禽类羽毛和水产养殖业产生的废弃蛋白质。因此，该弹性蛋白酶在农业、养殖业等行业中产生的废弃的、难以水解的蛋白类物质有着良好的应用前景[2]。铜绿假单胞菌是条件致病菌的，这种微生物在代谢过程中会产生绿脓素等有致病性的次生代谢产物。所以，直接利用这种微生物通过生物转化来利用废弃角蛋白类、弹性蛋白类含氮源农副产品是存在着严重的生物安全性的问题。同样，该菌株的致病性和该菌产生次生代谢产物的不安全性将限制通过这种菌株来发酵生产弹性蛋白酶的工业化生产过程。因此，将lasB基因在安全、高效的宿主里表达是将弹性蛋白酶广泛应用的前提。源'自^优尔],论`文'网]www.youerw.com

自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来，作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，它还具有以下的优势： 

（1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；  

（2）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；  

（3）外源蛋白基因遗传稳定。外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能够到高表达菌株； 

（4）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

目前已筛选到高产弹性蛋白酶的菌株Pseudomonas aeruginosa C11，并且该菌株的lasB基因已经成功在毕赤酵母中成功高效表达，并对重组蛋白进行了纯化和研究。另外，该弹性蛋白酶中存在三个N-糖基化位点（I38T、A69T和N266T），本研究主要就是通过基因定点突变去除糖基化位点，来研究其对重组弹性蛋白酶活性的影响，总共包含7种突变菌株，分别为包含定点突变I38T，A69T，N266T，I38T/A69T，I38T/N266T，A69T/N266T和I38T/A69T/N266T突变类型的菌株。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 质粒和菌株

含有目的基因的Pseudomonas aeruginosa C11菌株有论文导师韩铭海老师提供；大肠杆菌感受态DH5α购自上海捷瑞生物工程有限公司；克隆质粒pGH-T质粒购自上海捷瑞生物工程有限公司；毕赤酵母表达质粒pPIC9K购自上海捷瑞生物工程有限公司，有本实验室保存。

2.1.2 培养基

1、LB培养基（1L）：胰蛋白胨（Tryptone）10g、酵母提取物（Yeast extract）5g、氯化钠（NaCl）10g、pH7.0左右。