T7RNA聚合酶的合成与表达+文献综述(2)
M. Chamberlin 1970年第一次报道了T7 RNA 聚合酶，它是T7噬菌体基因Ⅰ的产物。在T7 RNA聚合酶的体外转录系统中，转录的产物常是模板的几倍甚至几百倍。由于T7 RNA聚合酶易于大量获得，价格比Sp6 RNA聚合酶便宜， 因此使用日趋广泛[4]。T7噬菌体的RNA聚合酶可特异识别T7噬菌体的启动子，并可作为唯一的酶蛋白成分独自催化T7基因的转录过程。基于T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子间特异性识别而建立起来的高效偶联表达系统已显示出了在真核生物基因工程中的巨大应用潜力[5]。
由于市场上可以买到的T7 RNA聚合酶的浓度比我们所需要的大规模合成工程要低，而且如果用于毫克水平上的RNA合成所需的费用也非常的高。所以，一般实验室中这些酶都是从含有带T7RNA聚合酶基因的质粒的大肠杆菌中分离得到的[6，7]。
根据已有研究，由于大部分蛋白质（包括酶）都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质（包括酶）则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质（包括酶）[8]。蛋白质（包括酶）的主要提取方法有以下几种：（1）水溶液提取法；（2）有机溶剂提取法；（3）双水相萃取法[9]；（4）酶法；（5）酸碱度法；(6) 反胶团相转移法[8]等。蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。由此可以用凝胶过滤法、超滤法、盐析法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。因而蛋白质（包括酶）的纯化方法包括：（1）根据蛋白质溶解度不同的分离方法；（2）根据蛋白质带电性质进行分离；（3）根据配体特异性的分离方法——亲和色谱法[8]等方法。
在上述各种蛋白质(包括酶)的分离提纯方法中亲和标记提纯方法已经彻底改变了蛋白质提纯领域。根据这个方法人们通过亲和标记提纯细菌、植物以及酵母菌核糖体[10-15]。可以分别使用抗链霉素蛋白键合适配子[12]以及MS2覆盖蛋白质键合标记[13]这两种方法与质粒上的rRNA操纵子结合。这些方法的设计主要是用于在rRNA上携带突变的大肠杆菌核糖体的提纯。其它方法包括Flag- 标签[11，14]或S肽标签[10]等。但是使用这些方法得到的核糖体产量为4%[15]到40%[13]，这样的产量相对过低，并不能满足我们对其使用的要求，因此我们需要一个更高效高产的方法进行对蛋白质(包括酶)的提纯分离。
为了达到以上目的，我们通过实验在野生型菌株MG1655的染色体位点上通过λ红外重组技术直接在蛋白质L12染色体的C末端插入一个6个His的标签[16，17]得到了一个新大肠杆菌菌株（JE28），该菌株用亲和色谱法可简单提纯得到大量有6个His标记的核糖体，所得到的核糖体通过蔗糖梯度离心、凝胶电泳以及蛋白质合成等实验，结果证明使用该方法得到的核糖体产率更高而且活性更强[18]。因此在本次构建体外转录系统实验中我们采用了这种最高效、最高产且活性最高的方法进行了T7RNA聚合酶的分离与提纯。
而根据现代分子生物学知识可知，RNA转录的基本过程包括：模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。具体过程为RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合，在RNA聚合酶的催化作用下，以4种三磷酸核苷（NTPs）为原料，根据碱基配对原则（A-U，T-A，G-C），各核苷酸间通过形成磷酸二酯键相连，不需要引物的参与，从5’向3’合成RNA[19]。因此构建体外转录系统时需要加入最基本的：DNA、T7 RNA聚合酶、ATP、CTP、GTP、UTP，根据所查资料知还需要加入：Tris pH8.1、spermidine、MgCl2 、BSA、二硫苏糖醇、水等。在37℃下反应5h左右即可完成体外转录。
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