摘  要对于大多数未知的生物基因组序列，可以通过染色体步移技术来获取已知区段两侧的DNA序列[1]。染色体步移技术由于所采用的引物退火温度差异较大，先进行高退火温度的高特异性反应，再进行低退火温度的特异性反应，最终能获得含量十分高的特异性产物[2]。通过3次热不对称PCR反应扩增出已知序列的两侧序列，可重复操作验证未知序列片段的正确性。用CTAB法抽提甘薯徐紫薯3号品种叶片的总DNA,设计特异性引物进行PCR，对获得的PCR产物进行DNA测序。由扩增结果再设计验证引物，验证引物的扩增结果与已知序列和第一次扩增结果对比，显示有重复区段则可知第一次的扩增结果正确。69165

毕业论文关键词：染色体步移  特异引物  PCR  扩增序列

The Sequence Amplification of Sweet Potato Gene IbANR 5’ end

Abstract

For most organisms, only using genome walking kit to know DNA sequence of a known region both sides before have less kowledge of their genome sequence. Because of high annealing temperature differences between primers, first do high specificity reaction with high annealing temperature ,then do low specificity reaction with low annealing temperature，make the reaction cycling. Eventually obtain a very high content of specific products. Through three thermal asymmetric PCR reaction can obtain the flanking sequences of known sequences can be used to verify correctness of the unknown sequence fragments by repeating the operation. Extracting purple potato no.3 variety leaves' DNA by CTAB extraction, then design specific primers to do PCR reaction,and get on DNA sequencing of PCR products obtained. Designing verified primer according to the amplification sequence, make  the amplification of verified primer compared with known sequence and first walking kit result separately. If it illustrated that duplicate fragments exist, then could prove the first walking kit result is correct.

Key Words:genome walking kit  specific primers  PCR  sequence amplification

目  录

摘要----Ⅰ

Abstract----Ⅱ

目录----Ⅲ

1 绪论-6

2 材料与方法--7

2.1材料7

2.2试剂7

2.3仪器7

2.4样品的准备-8

2.5 PCR扩增----8

3 结果-12

4结论--15

参考文献---16

致谢----17

1 绪论

PCR扩增的原理：PCR是一种能选择性地体外扩增DNA或RNA片段的方式。单链DNA在互补寡聚核苷酸片断的引导下，可以在DNA聚合酶的催化下按5’→3’方向复制出其互补DNA链，并形成双链DNA。在DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，反应时首先是在摩尔数过量的两段引物及4种dNTP存在下，将模板进行加热变性。一定时间后，模板DNA已加热到大约94℃，使模板DNA的双链或者经PCR扩增形成的双链DNA解离，变成单链，有助于使它和引物结合，进入到下一轮反应 [3]；模板DNA经过加热变性变成单链之后，迅速冷却到某一温度，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合的过程，称之为退火[4]。然而，在温度的控制和DNA聚合酶的作用之下，退火引物能够进行延伸。增加“变性-退火-延伸”的循环过程，就可以获取到更多的半保留复制链，并且在重复过程中，前一次的循环产物DNA可作为后一次循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增，2-3小时之后待扩增的目的基因就能将被放大几百万倍，因此这一反应又称作为链式扩增反应。循环次数会影响PCR的扩增程度，而循环次数主要由模板DNA的浓度决定，同时对DNA的质量要求也很高，需多次纯化。文献综述

染色体步移是用对已知的基因或分子连续步移，以获取并鉴定已克隆的特定DNA片段侧翼顺序的方法。通过以PCR技术为基础的染色体步移技术，能够在预先不了解该区域序列信息的情况下，设计特异性引物来扩增该未知区域[1]。本次实验选择的TaKaRa试剂盒的原理是根据已知的IbANR的基因组序列设计3条序列较长的、退火温度较高的特异性引物，与位于未知序列处的随机简并引物组合，进行3次热不对称PCR[5]，两种引物利用退火温度的差异，从而获得目的产物[6]。特异性引物设计原则是：根据经过验证的IbANR的已知基因组序列设计三个特异性引物，设计方向是你所需要扩增的未知区域的方向，引物SP2应设计在引物SP1内侧的位置，引物SP3在引物SP2的内侧位置。对相邻的两个引物之间的距离没有严格的界定，一般在60bp-100bp之间。[7]设计的引物长度为22-26nt，GC含量为45-55％，引物的Tm值计算公式：Tm=69.3+0.41（G/C）%×100-650/L（引物碱基数），其他要求和普通PCR反应用引物相同。