（3）Primestar Mix(2 )：宝生物工程有限公司

   （4）Seamless Cloning Master Mix：上海生工生物科技有限公司

(5) XhoⅠ、NdeⅠ、SalⅠ：宝生物工程有限公司

1.3  普通试剂

蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉、去离子、溴化乙锭、Tris 、HCl、Glucose、Na2EDTA·2H2O 、EDTA、SDS、NaOH、KOAc、CH3COOH、氨苄青霉素[Amp]。以上的试剂都于上海生工生物科技有限公司购买。

1.4  缓冲液和溶液

50 × TAE缓冲液、溴化乙锭溶液 (EB:10 mg/mL)、TSolutionI、SolutionII 、SolutionIII(pH < 4.8)、E-RNase缓冲液、1 TE Buffer缓冲液、LB液体培养基、LB固体培养基(+100 mg/ml的氨苄青霉素[Amp]) 。

1.5  仪器设备

漩涡混合器XH-C（金坛市）、台式离心机TGL-16B（上海）、天呈恒温摇床TS-200B（上海）、定时恒温磁力搅拌器90-2（上海）、Eppendorf移液器系列1000μL, 200μL, 100μL, 10μL, 2.5μL（德国）、全自动电脑干燥箱DHG-9240C（杭州）、立式压力蒸汽灭菌器LDEX-50FBS（上海）、凝胶成像分析系统GELX1520（上海）、制冰机FM70A（中国格兰特）、低速式大容量离心机（上海）、PCR仪MG96+（杭州）、格兰仕微波炉WD700（佛山格兰仕公司）、电子天平BX320D（德国Sartorious）、三恒电泳仪EPC3000（北京六一）、PCR仪MG96+（杭州）、紫外分光光度计UV-7504（中国）、电冰箱海尔BCD-271TMCM（青岛）。

2 方法

2.1 相关溶液制备

（1）LB培养基的制备方法

①首先称取以下试剂，放置于1L的烧杯中。

  胰蛋白胨（10g）、酵母提取物（5g）、NaCl（10g）

②大约加入800ml的去离子水，用磁力搅拌器充分搅拌，将其溶解。

③再滴加5N NaOH，将pH值调节至7.0。

④然后加入去离子水将溶液定容至1L。

⑤高压蒸汽灭菌锅灭菌后，最后4 保存。

（2）LB/Amp培养基的制备方法

①首先称取以下试剂，放置于1L的烧杯中。

  胰蛋白胨（10g）、酵母提取物（5g）、NaCl（10g）

②大约加入800ml的去离子水，用磁力搅拌器充分搅拌，将其溶解。

③再滴加5N NaOH，将pH值调节至7.0。

④然后加去离子水将溶液定容至1L。

⑤高压蒸汽灭菌锅灭菌后，等待冷却至室温。

⑥最后加入1ml Ampicillin（100mg/ml），均匀混合，4 保存。

（3）50 TAE Buffer的制备方法

①首先称量以下试剂，放置于1L的烧杯中。

  Tris（108g）、Na2EDTA·2H2O（7.44g）

②在烧杯中大约加入800ml的去离子水，用磁力搅拌器充分搅拌，将其溶解。

③然后加入57.1ml的醋酸，用磁力搅拌器充分搅拌。

④最后用去离子水定容至1L后，室温保存。

（4）TE-RNase缓冲液

①首先将10 µg/L 的RNase加入TE溶液中。

②高压蒸汽灭菌锅灭菌后，4℃保存。

（5）Solution Ⅰ的制备方法

①首先量取以下溶液，放置于200ml的烧杯中。

  1M Tris-HCl(pH8.0)（5ml）、0.5M EDTA(pH8.0)（4ml）、20% Glucose(1.11M)（10ml）、灭菌水（181ml）

②高压蒸汽灭菌锅灭菌后，4 保存。

（6）Solution Ⅱ的制备方法

①首先量取以下溶液，放置于200ml的烧杯中。

  10%SDS（20ml）、2N NaOH（4ml）、灭菌水（176ml）

②然后加入灭菌水将溶液定容至200ml，用磁力搅拌器充分混匀。

③室温保存，而且此溶液配制一个月后就不能使用。

（7）Solution Ⅲ的制备方法

①首先称量以下试剂，放置于200ml的烧杯中。