2.2.2 嗜盐菌菌落形态观察及菌体特性初步鉴别

运用革兰氏染色方法，先用95%酒精棉球将载玻片轻轻擦拭后用水冲洗晾干，滴加适量的蒸馏水于载玻片中央，用无菌接种环从培养基上挑取少量菌，与载玻片上的水滴混匀，涂成薄菌膜。涂片干燥后在微火上通过3次进行固定。待冷却后，滴加草酸铵结晶紫染色液盖满菌膜，初染2分钟后水洗。再滴加碘液，媒染2分钟后水洗。用95%乙醇进行脱色约45秒，水洗。滴加番红染液，复染3分钟后水洗。最后用吸水纸将载玻片轻轻擦干后镜检观察。论文网

2.2.3 嗜盐菌株基因组总DNA序列提取

按照上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明，进行序列提取。具体步骤如下：（1）配制嗜盐菌液体培养基，将纯菌种接种于液体培养基中过夜培养，培养后吸取含细菌细胞的培养液1mL，加入离心管，10000 rpm离心1分钟，彻底弃去上清液体，收集下部菌体沉淀物；（2）往收集到的菌体中加入180μL溶菌酶溶液，用移液枪枪头轻轻吹打，将菌液充分混匀，37℃酶解45分钟；（3）加入20μL Proteinase K溶液混匀，56℃裂解细胞30分钟；（4）加入20μL RNase A混匀，室温放置5分钟；（5）加入200μL BD Buffer混匀，70℃保温10分钟；（6）加入200μL 无水乙醇充分混匀；（7）在收集管中放入UNIQ-10吸附柱，用移液枪将溶液全部加入吸附柱中，静置2分钟，12000 rpm离心3分钟，弃去收集管中的液体；（8）向吸附柱中加入500μL PW Solution，10000 rpm离心1分钟后，将收集管中的液体倒掉；（9）在吸附柱中加入500μL Wash Solution，10000 rpm离心1分钟，弃去收集管中的液体；（10）将吸附柱放回收集管，12000 rpm离心2分钟，用以除去柱中残留的Wash Solution；（11）将吸附柱放入另一洁净的离心管中，预热Elution Buffer至60℃，在柱中央加入60μL Elution Buffer，37℃放置3分钟，10000 rpm离心1分钟；（12）离心管中的液体即为基因组DNA，将其放置于-20℃保存。

2.2.4 16S rRNA基因序列的PCR扩增

（1）PCR 反应体系（50μL）：2×Taq Mix 25μL，正反向引物各2μL，DNA模板1μL，超纯水20μL。

（2）PCR扩增的引物为细菌通用引物，正向引物为27F：5’AGAGTTTGATC

ATGGCTCAG 3’，反向引物为1492R：5’CTACGGTTACCTTGTTACGAC 3’[4]。

（3）PCR扩增反应条件：

预变性 temp=94℃，2分钟

变性   temp=94℃，40秒

退火   temp=55℃，40秒            

延伸   temp=72℃，1分钟 

共运行30个循环。

延伸   temp=72℃，10分钟

（4）PCR扩增过程结束后，将获得的产物保存于-20℃冰箱中。

2.2.5 电泳检测PCR产物

配制琼脂糖凝胶（1%）：琼脂糖1g、50×TAE 2 mL、蒸馏水98 mL。

提取2.5μL PCR产物，90V电压，电泳30分钟。电泳结束后，将凝胶取出放入EB染液中浸泡染色20分钟，再经过漂洗液漂洗1分钟。采用GelX1520凝胶成像分析系统观测并记录PCR扩增结果。

2.2.6 16S rRNA基因测序

将PCR扩增产物寄送到南京斯普金生物科技有限公司，由公司进行序列测序。

2.2.7 16S rRNA基因序列分析

    使用ContigExpress软件对测序后得到的结果进行拼接，连接后即获得16S rRNA的基因序列。序列中每个碱基都有相对应的图谱，分析峰图可以确认序列的可信性。

2.2.8 构建系统进化树

登录EzBioCloud网站，进入EzTaxon选项，输入待分类的嗜盐菌株的16S rRNA序列，自动搜索数据库，可以获得与之相似程度高的邻近模式菌株和其他相关菌株序列。使用MEGA 7.0软件运用Neighbor-Joining法[5]，对待分类的嗜盐菌株和相关的模式菌株进行分类分析，构建系统进化树，重复取样1000 次[6]。