摘  要 ：采用透析袋浓缩、亲和层析（Ni Sepharose 6 Fast Flow）等纯化步骤对巴斯德毕赤酵母产的内切葡聚糖酶进行分离纯化，再通过SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度检测和分子量测定，得到纯化的内切葡聚糖酶的比活力为145.96，分子量为50kDa,最适温度为55℃，最适pH为5.0, Zn2+、Mg2+、Cu2+和 K+对该酶有激活作用，Ca2+、Al3+对该酶有抑制作用。70566

毕业论文关键词：内切葡聚糖酶，巴斯德毕赤酵母，纯化 ，酶学性质研究

Abstract: In this study, endoglucanase which pichia pastoris produced was separated and purified by dialysis concentration and affinity chromatography（Ni Sepharose 6 Fast Flow）,  and then using SDS-PAGE gel electrophoresis to determine the purity and molecular weight. We have come to the conclusion that the specific activity of endoglucanase is 145.96. The molecular mass of the endoglucanase is 50kDa.The optimum temperature and pH of the endoglucanase were at 55℃ and pH 5.0, respectively. Zn2+, Mg2+, Cu2+ and K+ have a role in the activation of the enzyme, or Al3+ and Ca2+ have inhibitory effect on the enzyme.

Keywords：endoglucanase，Pichia pastoris，Purification，enzymatic properties

目录

1  前言 5

1.1 毕赤酵母表达体系 5

1.2  纤维素酶概述 6

2  材料 7

2.1主要仪器和设备 7

3  方法 7

3.1 主要试剂及培养基的配置 7

3.2 内切葡聚糖酶的纯化 8

3.2.1  扩大培养菌种及离心 8

3.2.2  透析袋浓缩 8

3.2.3  Ni亲和层析（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE，USA） 9

3.3 酶学性质研究 11

3.3.1 内切葡聚糖酶活力的测定 11

3.3.2 pH的影响 11

3.3.3 温度的影响 11

3.3.4 金属离子的影响 11

4  结果 12

4.1  内切葡聚糖酶的纯化 12

4.2 内切葡聚糖酶的最适pH 12

4.3 内切葡聚糖酶的最适温度 13

4.4 金属离子对内切葡聚糖酶的影响 14

4.4 纯化过程中的纯化参数 14

结论 16

参考文献 17

致  谢 18

1  前言

1.1 毕赤酵母表达体系

 巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒[1]。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX[2]。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达[3]。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害[4-8]。