巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,Pp)表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。Pp的如下优点是促成此表达系统在近十几年里迅速发展和被广泛应用的重要原因:Pp为单细胞真核生物,生长快,易于分子遗传学操作；Pp的醇氧化酶1(Alcohol Oxidase 1, AOX 1)基因的启动子具有强诱导性和强启动性,适于外源基因的高水平诱导表达；Pp具有强烈的好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养,利于大规模工业化生产；Pp可高水平分泌表达外源蛋白,纯化方便；Pp具有真核细胞的翻译后修饰功能[9]。

1.2  纤维素酶概述文献综述

纤维素酶是自然界中对纤维素起降解作用的一系列糖苷水解酶的总称， 是在降解纤维素过程中起协同作用的多组分酶， 按其催化功能可分为内切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan-4-glucanohydro-lases，EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶 （1，4-β-D-glucanglucanohydrolases，EC 3.2.1.74） 和 β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases，EC 3.2.1.21）[10]。自然界中纤维素酶的来源相当广泛， 包括昆虫、原生动物、细菌、放线菌及真菌等。 目前研究较多的纤维素酶生产菌株主要集中在胞外酶活力较高 的 木 霉 属 （Trichoderma）、 青 霉 属 （Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）等真菌，其中里氏木霉（T.reesei）的相关研究最多。

纤维素类物质是地球上最丰富的可再生资源之一， 目前自然界中的纤维素绝大多数没有得到有效利用， 并且还造成环境污染， 因此利用纤维素酶对其进行生物转化，对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。纤维素酶在食品工业中有广泛的应用，如应用于提高果蔬出汁率，果汁的澄清，提高白酒的出酒率，生物活性功能成分提取，茶叶加工，壳寡糖制备等。 除此以外，纤维素酶还在造纸、洗涤、纺织、动物饲料和制药等领域有着重要的应用价值[11]。

真菌分泌的纤维素酶类存在着各酶组分比例不合理的问题，这会导致真菌纤维素酶对底物不能产生很好的酶解效果。同时，纤维素酶系的复杂性也导致其不易纯化和结晶，使得各组分的功能及酶解机制研究较欠缺。只有通过分离纯化得到纯酶，才能对其各组分及同工酶的性质及相互协同关系进行研究，为纤维素降解机制、纤维素酶分子结构、酶的基因克隆等的研究提供理论依据。纤维素酶的分离纯化已有研究，大多是对酶组分进行了初步分离，或是对其中一种组分进行分离鉴定。

本实验通过透析袋浓缩和亲和层析对巴斯德毕赤酵母产的内切葡聚糖酶进行分离纯化，再用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化后的内切葡聚糖酶进行纯度检验和分子量的测定[12-17]。最后对内切葡聚糖酶的最适温度、最适pH等酶学性质进行研究。

2  材料

2.1主要仪器和设备

    2S-75HJ型高压灭菌锅                     江阴滨江医疗设备有限公司

    HD-930型组合式全温摇床                  太仓市博莱特实验仪器厂

    SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台           苏州净化设备有限公司

    高速冷冻离心机HR21M                   湖南赫西仪器设备有限公司

电子天平BS210S                         北京赛多利斯天平有限公司

DYY-10C型凝胶电泳仪器                  北京市六一仪器厂

HD-930DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱   上海精宏实验设备有限公司