2。3突变位点选择 11

2。4 蛋白含量的测定 11

2。5热稳定性分析 12

3。讨论 12

致谢 13

参考文献 14

引言

核酸酶是一类水解核酸磷酸二酯键的酶，几乎在所有生物体中都含有各种核酸酶。通过裂解相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，来降解DNA和RNA分子的酶。核酸酶可以分为核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶和非特异性核酸酶。非特异性核酸酶是核酸酶的一种，它可以非特异性地水解DNA和RNA，无论是单链、双链、线状、环状还是超螺旋形式，而且对核酸的序列没有要求。核酸酶在遗传机制的不同方面起着重要作用。如避免突变、DNA修复、DNA复制和重组、为生长代谢清除核酸和磷酸、宿主防御外援的核酸、冈崎片段起始RNA的去除，凋亡DNA的降解等[1-8]。同时非特异性核酸酶被广泛应用于分子生物学，例如RNA的快速测序、抗病毒试剂等。论文网

酶是一种生物催化剂，具有催化性高，反应专一性强，在温和条件下催化反应等特点。但是工业用酶所要求的反应条件往往与酶所处的自然环境条件下不同。这种差异主要表现在几个方面，其中最重要的就是酶的热稳定性[9-11]。大多数工业酶催化的反应宜在较高温度下进行，这是因为提高反应温度可以促进反应速度，提高底物溶解度，同时防止杂菌污染。因此，为开拓酶的应用，有必要研究耐高温，热稳定性强的酶。

蛋白质工程中，常使用定点突变技术改变酶的物理化学性质，包括酶的热稳定性。如在体外进行氨基酸残基密码子的替换，基因重组等。通过观察酶的立体构象特征，在不破坏酶活性的前提下应用定点突变改变酶的氨基酸序列。酶的热稳定性是一个复杂的效应，并不是受单个或几个因素的影响，它是酶蛋白中所有共价和非共价结合力的一个综合效应，影响因素较多，包括疏水作用，盐键及氢键、共价键的稳定，增加包装效率，降低构象变化，降低去折叠熵值以及α-螺旋、环等二级结构的稳定[12]。

天然存在的低温酶在低温条件下催化作用较高，但是热稳定性一般较差，不利于工业应用。因为水合反应大量放热容易导致酶的失活与副产物的增加，实际生产中就需要大量冷  却剂（液氨、冷冻盐水等）将反应温度控制在15-20℃，增加了生产成本[13-16]。研究发现，大部分热稳定性好的核酸酶的最适酶促反应温度也偏高， 而最适酶促温度接近40℃的核酸酶则热稳定性较差， 所以目前还有必要继续寻找更高耐热性优质核酸酶， 以促进核酸酶的普遍推广使用。而在已存在并投入使用的核酸酶中，为了保证核酸酶的高效利用率，提高其热稳定性是一种有效的措施。所以，筛选耐热性更好的核酸酶以及探索更好的提高核酸酶的热稳定性的方法仍是研究的重点。文献综述

实验和理论的研究揭示，许多重要的结构特征都涉及影响蛋白质的热稳定性。如二硫键、疏水相互作用、氢键、填料、构想应变、二级结构、柔性和刚性等。二硫键（disulfide linkage），又称S－S键。是2个SH基被氧化而形成的—S—S—形式的硫原子间的键。在生物化学的领域中，通常系指在肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键。此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使成为线状多肽链。近年来，许多学者不但证明存在于蛋白质中的二硫键对维持蛋白质构象和热稳定性的重要作用，而且通过引进新的二硫键增加了原有蛋白质的热稳定性。来源于嗜热菌Methanococcus jannaschii的甲羟戊酸激酶结构中含有一对二硫键Cys107-Cys281，而存在于小鼠中的甲羟戊酸激酶则不含有二硫键，Xiusheng Chu等[18]应用定点突变方法证明了二硫键对维持Methan- ococcus jannaschii甲羟戊酸激酶热稳定性的重要作用，而且向小鼠甲羟戊酸激 酶突变体A141C中引入一对二硫键，其热稳定性得到了增强。