大豆根瘤菌是与豆科植物结瘤的共生固氮[8]的菌，可以在土壤中长期以腐生菌的状态存在, 或作为植物内生菌存在于非豆科植物体内。根瘤菌可以在豆科植物的根或茎上诱发其皮层细胞增生, 形成瘤。大量的根瘤菌在瘤中转化为专门进行固氮的类菌体,将大气氮还原为氨并提供给其宿主植物合成蛋白质。由于该共生体固定的氮素占全球固氮总量的主要部分, 因此根瘤或茎瘤固氮共生体系具有重要的生态和经济价值,在农、林、牧业的可持续发展中具有重要作用。生物固氮[9]在提升大豆营养品质的同时，可以减少化学氮肥的流失及对环境的破坏, 降低大豆生产成本和提高大豆产量和质量[10]。此外，我们前期研究发现根瘤菌还能促进大豆对盐碱环境的适应能力，但其分子机制尚不明确。本研究将分析根瘤菌对大豆耐盐响应基因转录表达水平的影响。

1 材料与方法

1。1  大豆的栽培

试验材料：Union85140盐敏感大豆。由中国农科院作物科学研究所邱丽娟研究员惠赠，并在杭州师范大学下沙生科院光照培养间中种植。

1。1。1 大豆种子的灭菌处理 

根据试验要求选取一定数量的色泽均匀、大小一致的大豆种子，先用温水30～40℃浸泡1 h，将无菌水和漂白水按照3:1的比例配制一定量的消毒水（大约200ml）。将大豆种子在消毒水中浸泡10min，并振荡摇匀，使种子与溶液充分接触，重复2次。将大豆种子用无菌水清洗浸泡5min，振荡摇匀，重复4次。28℃暗培养过夜。

1。1。2 大豆种子的春化、萌发

配制1。5%Agar培养基（1。5gAgar加到100ml水中）。将消过毒的大豆种子放入Agar培养基中，将培养基放置在4℃冰箱中春化。48h后观察培养基中大豆种子的萌发情况。春化后转入30 oC培养箱进行培养至大豆萌发。一般萌发需2天。文献综述

1。1。3 大豆种子的种植 

将营养土与珍珠盐按照3:1的比例混合均匀，加入一定量的水，充分搅拌。将拌好的土均匀分装在32孔的穴盘上，每个穴盘需贴好标签，并做上记号。将处理好的大豆种子芽朝下分别种入土中，注意不要埋的太深，露出一部分，置于光照培养间中培养。

1。1。4 盐胁迫[11]处理、收样

移植后的第四天开始，每隔三天对相应的植株浇一次150mM浓度的氯化钠盐溶液，一个月后收样。收样时大豆植株的根易断并且有些结有根瘤菌，要小心移取和清洗。清洗干净后用纸巾轻轻擦干，将根、茎、叶分别剪下，用锡箔纸包好，写上标记，放入-80℃冰箱中保存。本次实验有不加根瘤菌不加盐、不加根瘤菌加盐、加根瘤菌不加盐、加根瘤菌加盐这四种大豆植株的根、茎、叶，因此共有12个样品，并将这12个样品从1-12号依次编号标记。样品的研磨：从-80℃冰箱中取出样品，用液氮将研钵和钥匙预冷，将取出的样品的根、茎、叶分别进行碾磨，至细粉末后迅速用药匙将粉末装入50 ml离心管中，统一将研磨好的样品放入-80℃冰箱中保存，备用。

1。2  大豆植株总RNA的提取

1。2。1 材料、仪器设备及试剂

本研究采用康为世纪的植物RNA提取试剂盒进行大豆总RNA的提取实验。

1。 材料  大豆植株的根、茎、叶粉末 

2。 仪器设备   4℃离心机；漩涡震荡仪；30℃培养箱；超净工作台

3。 试剂   (1)β-巯基乙醇  (2)无水乙醇  (3)Buffer RL  (4)Buffer RW1  (5)DNase I混合液（自己配置） (6) Buffer RW2  (7)RNase-Free Water

1。2。2 试验方法

实验步骤：

1）取约0。5g样品，为防止RNA降解，趁粉末自然液化之前，迅速转入1。5mL离心管（约至0。7~0。8mL高度）中，加入700uLBuffer RL（使用前加入1%β-巯基乙醇），混匀，并漩涡震荡，使之充分裂解。