3）1%琼脂糖凝胶

称取0。3g Agarose于锥形瓶中，并量取30mL的1×TAE电极缓冲液加入瓶中。将其置于微波炉中加热2分钟左右至琼脂糖完全溶解至呈透明液体，取出待其稍微冷却后加入1。5uL核酸染料至终浓度为0。5ug/mL，轻轻摇晃均匀。将冷却液倒入插制胶模具中，并插上样孔梳，置于室温下凝固。凝固后取出样孔梳，将凝胶块置于电泳槽内，加入适量1×TAE电极缓冲液至液面稍高于凝胶块。

1。2 实验方法

1。2。1 嗜热光合绿丝菌总基因组DNA的提取

1）事先配制PE培养基250mL并在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟。接种由本实验保存的Roseiflexus castenholzii菌种至已灭菌冷却的PE培养基中，并加入一定量的PE培养基将培养瓶填满。接种结束后放置在恒温光照培养箱中进行扩大培养。

2）约20天后，取2mL菌液于1。5mL离心管中，12000rpm离心1分钟，离心结束后弃除上清[10]。

3）向离心管中加入700uL CTAB裂解液（65℃预热），轻轻颠倒混匀之后加入30uL 蛋白酶K溶液，65℃水浴约一小时。

4）向离心管中加入700uL氯仿/酚/异戊醇混合液（24:24:1），轻轻摇晃颠倒混匀。12000rpm离心10分钟。离心结束后将上清液移至另一新灭菌过的1。5mL离心管中，并加入10uL 10mg/mL RNaseA，置于37℃水浴中30分钟。文献综述

5）加入两倍体积的无水乙醇后充分摇匀并置于-20℃冷藏30分钟。

6）将絮状沉淀和溶液转移至吸附柱中，静置2分钟后12000rpm离心2分钟，离心后弃除废液。

7）向吸附柱内加入700uL漂洗液后12000rpm离心1分钟，弃除废液[11]。重复此步骤洗涤两次。洗涤后将吸附柱在室温条件下放置，使多余的乙醇挥发，防止影响后续的洗脱。

8）将吸附柱放置在一灭菌过的新的离心管，加入50uL的洗脱液（提前预热）后静置约5分钟，12000rpm离心2分钟，洗脱液即总基因组DNA，保存条件为4℃冷藏。

1。2。2 目的基因的PCR扩增

1）引物设计

引物名称 引物序列

FAu-R3 ATGAAGATGCACAAGTCCTTGTG

FAu-F3 CGGCGCGACCGTCATCA

2）PCR扩增

PCR总反应体系为25uL

PCR反应体系 反应体积

SH2O（无菌水） 11。0 uL

FAu-R3 0。5 uL

FAu-F3 0。5 uL

光合绿丝菌总基因组DNA 0。5 uL

Takara Premix Taq 12。5 uL

总体积 25。0uL

PCR扩增条件

温度 时间

94℃ 5分钟

94℃ 1分钟

56℃ 30秒     30个循环

72℃ 30秒

72℃ 10分钟

4℃ 保存

PCR扩增后的产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测

1。2。3 PCR产物切胶回收

1）取适量PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收操作（做两个相同的样品，标记为A、B）：

2）电泳结束后，稍待凝胶冷却，在紫外灯下切取含有目的基因的凝胶小块。计算切取所得的凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积（例如100mg=100uL）

3）往含有切碎的凝胶块的1。5mL离心管中加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,混匀后于65℃水浴锅中加热6-8分钟直至凝胶块完全熔化。